毛细管电泳的应用前景

一, 毛细管电泳的兴起与发展

    毛细管电泳(capillary electrophoresis, CE),又称高效毛细管电泳(HPCE)是近年来发展**快的分析化学研究**域之一.1981年Jorgenson等[1]在75μm内径的毛细管内用高电压进行分离,创立了现代毛细管电泳.1984年Terabe等[2]发展了毛细管胶束电动色谱(MECC).1987年比Hjerten[3]建立了毛细管等电聚焦(CIEF),Cohen和Karger[4]提出了毛细管凝胶电泳(CGF).1988—1989年出现了**批CE商品仪器,1989年**届**际毛细管电泳会议召开,标志了一门新的分支学科的产生.短短的几年内,由于CE符合了以生物工程为代表的生命科学各**域中对生物大分子(肽,蛋白,DNA等)的高度分离分析的要求,得到了迅速发展,正逐步成为生命科学及其它学科实验室中一种常用的分析手段.近三年来**际毛细管电泳会议与会者均达700—800人,1996,1997两年公开发表的有关CE论文达3600余篇.可参见相关综述则[5-8].欧洲,美****内及日本也相继召开CE地区性**际会议.我**在CE**域研究起步早,发展快,研究工作较全面,有的研究成果达到**际先进水平.定期召开全**CE会议及亚太地区**际会议,在**际上已有一定的影响.1984年中**科学院化学所竺安教授在**内率先开展CE研究,迄今**内已有几百个单位开展CE研究和应用.从CE理论到各种模式及各方面应用,**内均在进行.1998年举行的第三届全**CE会议共收录论文129篇,同时举行的第二届亚太**际会议也取得了成功.毛细管电色谱(CEC),CE/MS联用,低背景毛细管梯度凝胶电泳,手性药物分离,逆流聚焦及脱氧核糖核酸(DNA)各种CE测定方法等一批研究成果均达到**际先进水平.

二, 毛细管电泳基本原理

    CE是以高压电场为驱动力.以毛细管为分离通道,依据样品中各组成之间淌度和分配行为上的差异,而实现分离的一类液相分离技术.仪器装置包括高压电源,毛细管,柱上检测器和供毛细管两端插入又和电源相连的两个缓冲液贮瓶,在电解质溶液中,带电粒子在电场作用下,以不同的速度向其所带电荷相反方向迁移的现象称电泳.CE所用的石英毛细管在PH>3时,其内液面带负电,和溶液接触形成一双电层.在高电压作用下,双电层中的水合阳离子层引起溶液在毛细管内整体向负极流动,形成电渗液.带电粒子在毛细管内电解质溶液中的迁移速度等于电泳和电渗流(EOF)二者的矢量和.带正电荷粒子**先流出;中性粒子的电泳速度为"零",故其迁移速度相当于EOF速度;带负电荷粒子运动方向与EOF方向相反,因EOF速度一般大于电泳速度,故它将在中性粒子之后流出;各种粒子因迁移速度不同而实现分离,这就是毛细管区带电泳(capillary zone electrophoresis,CZE)的分离原理.CZE的迁移时间t可用下式表示:
式中,μep为电泳淌度,μen为电渗淌度,V为外加电压,ιt为毛细管总长度,ιd为进样到检测器间毛纫管长度.理论塔板数N为:
式中,D为扩散系数.分离度R为<BR>式中,μ1,μ2分别为二溶质的电泳淌度,μep为二溶质的平均电泳淌度.
从式(11.2)可看出,CE的N是和溶质的扩散系数D成反比,而高效液相色谱 (HPLC)的N和D成正比,因此扩散系数小的生物大分子,CE的柱效比HPLC高得多.CE比HPLC有更高的分离能力,主要由两个因素决定:一是CE在进样端和检测时均没有像HP比的死体积;二是CE用电渗流作推动流体前进的驱动力,整个流体呈扁平型的塞式流,使溶质区带在毛细管内不易扩散,而HPLC用压力驱动使柱中流体呈抛物线型,导致溶质区带扩散,使校效下降
    CE将经典电泳技术和现代微柱分离有机地结合,取得了比HPLC和平板凝胶电泳更多的优点.概括起来可谓三高二少一广.高质量灵敏度:常用紫外检测器检测限可达10-13一10-15mol,激光诱导荧光检测器(LIF)则达10-19一10-21mol.高分辨率:每米理论塔板数为几十万,高者可达几百万乃**几千万.高速度:许多分析可在几十秒内完成.所需样品少:只需纳升(10-9)的进样量.成本低:只需少量的流动相和低廉的毛细管.应用范围广;除分离生物大分子外,还可用于小分了(氨基酸,药物等)及离子(无机及有机离子).甚**可分离各种颗粒(如细胞,硅胶颗粒等).
    CE发展迅速也得力于大批色谱工作者转向CE,在理论上提出了各种模型,如解释CZE中区带扩展及理论塔板高度模型,热影响模型,迁移速率和分离度模型等等[9-10].近年来基础研究集中于解决CE应用中一些**性问题.如EOF对分离,定量影响极大,故研究了测弱EOF的方法,阳离于存在下的EOF,还有在两个中性标记物之间夹一个缓冲液塞的三明治式方法测定EOF [11].EOF测定将解决CE定量问题.电泳淌度定量计算也在发展,如用金属阳离子的一些结构参数,定量得出结构—保留(电泳)间的关系(QSRR) [12]及计算手性化合物淌度的软件等.特别是各种优化方法用于优化CZE,MECC,CEC及手性分离的实验参数,如重叠分离谱(OBM),多变量统计设计及Plackett-Buman多变量实验设计[13]等.

三, 毛细管电泳分离模式

    按毛细管内分离介质和分离原理的不同,CE现有六种分离模式,分述如后.
1. 毛细管区带电泳(CZE)
    CZE分离机理是基于各被分离物质的净电荷与其质量比(荷质比)间的差异.迄今CZE仍是应用**多的模式,应用范围包括氨基酸,肽,蛋白,离子,对映体拆分和很多其它带电物质的分离.CZE常用介质为电解质水溶液,根据情况可加入不同有机溶剂或其它添加剂.还有一种非水CE,如在乙腈中加入嗡 盐(tropyltum)来分离多环芳烃化合物,现在发展到可不加支持电解质,直接用乙腈,甲酰胺,甲醇等作溶剂来进行非水CE[14].
毛细管凝胶电泳(capillary gel electrophoresis,CGE)
    CGE是将平板电泳的凝胶移到毛细管中作支持物进行电泳,不同体积的溶质分子在起"分子筛"作用的凝胶中得以分离.常用于蛋白质,寡聚核苷酸,核糖核酸(RNA),DNA片段分离和测序及聚合酶链反应(PCR)产物分析.CGE能达到CE中**高的柱效.为了解决人类基因组计划的**,即DNA测序的速度,已试制出96支毛细管阵列的DNA测序仪,并已有8支毛细管阵列的DNA测序商品仪器.凝胶的制备和不同模式令人关注,**近发展出—种低背景毛细管梯度凝胶电泳[15],在测定糖,寡聚核苷酸及人工模拟蛋白方面取得进展.还有报道采用亲和凝胶电泳来识别和鉴定基于DNA药物的结合蛋白等.
3. 毛细管胶束电动色谱(mfcellar electrokinetic capillary chromatography, MECC)
    采用表面活性剂(如十二烷基硫酸钠,SDS)在运动缓冲液内形成一疏水内核,外部带负电的动态胶束相,利用溶质具有不同的疏水性,因而在水相和胶束相(准面定相)间分配的差异进行分离,既能分离中性溶质又能分离带电组分的CE模式.MECC拓宽了CE的应用范围,主要用于小分子,中性化合物,手性对映体和药物等.常用表面活性剂有各种阴离子表面活性刑,阳离子表面活性剂,非离子和两性表面活性剂.也有用混合胶束,如阴离子表面活性剂和胆酸盐组合混合胶束.有报道采用脂肪醇的微乳液胶束电动色谱(MEEKC)有比MECC更高的柱效,更快的分析速度和容易控制"窗口" [16].我们也成功地用MEEKC同时分离测定酸性和碱性蛋白.
4. 毛细管等电聚焦(capillary isoelelectric focusing,CIEF)<BR>用两性电解质在毛细管内建立pH梯度,使各种具有不    同等电点的蛋白质在电场作
用下迁移到等电点的位置,形成窄的聚焦区带.已成功地用于测定蛋白质等电点,分离<BR>异构体等.如用CZE和CIEF研究制备过程中糖蛋白不同糖基化程度引起的非均一性,<BR>结果表明CIEF方法要比CZE的好[17].
5. 毛细管等速电泳(capillary isotachophoresis,CTTP)<BR>采用先导电解质和尾随电解质.使溶质按其电泳淌度不同得    以分离,是一种较老的方式.现在常用作柱前浓缩方法用以富集样品,以解决CE测定中浓度灵敏度不如服比的问题,如HPLC的问题,如在线ITP—CZE即是成功的模式[18].
6. 毛细管电色谱(capillary electrochromatography,CEC)
    将HPLC中众多的固定相微粒填充到毛细管中(或涂渍到管壁).以样品与固定相之间的相互作用为分离机制,以电渗流为流动相驱动力的色谱过程称为CEC[19-20]. CEC将CE的高效和HPLC的高选择性相结合,得到了CE研究者的青睐.90年代初解决了毛细管填充技术后,CEC发展迅速,HPCE'97会议上已达35篇论文,HPCE'98又创54篇之多.CEC可分为开管CEC(即管壁涂渍固定相)和填充CEC.我**学者在CEC方面作了大量研究工作,对CEC的理论,反相电色谱,正相电色谱,离子交换电色谱及电色谱手性分离等模式均作了较系统研究[21-23],连续两年在**际CE会上作大会报告,目前已在ODS,硅胶,氰基,胺基,阴,阳离子交换树脂等10余种填料CEC柱上进行研究,开管CEC也发展了一些新技术,如硅胶—溶胶法在管壁涂渍C8固定相[24],分子印刷法分离手性化合物[25].
    以上六种模式为CE基本模式,此外如亲和,**毛细管电泳发展趋势亦较好.

四,毛细管电泳柱技术

    毛细管是CE的核心部件之一.早期研究集中在毛细管直径,长度,形状和材料方面,目前集中在管壁的改性和各种柱的制备.
1. 动态修饰毛细管内壁
    管壁改性主要是消除吸附和控制电渗流,通常采用动态修饰和表面涂层两类方法.动态修饰采用在运行缓冲液中加入添加剂,如加入阳离子表面活性剂十四烷基三甲基溴化铵(TTAB),能在内壁形成物理吸附层,使EOF反向.添加剂还有聚胺,聚乙烯亚胺(PEI)等,甲基纤维素(MC)可形成一中性亲水性覆盖层.
2. 毛细管内壁表面涂层
    涂层方法有很多种,包括物理涂布,化学键合及交联等 **常用的方法是采用双官能团的偶联剂,如各种有机硅烷,**个官能团(如甲氧基)与管壁上的游离羟基进行反应,使其与管壁进行共价结合,再用第二个官能团(如乙烯基)与涂渍物(如聚丙烯酰胺)进行反应,形成一稳定的涂层.此外还有将纤维素,PEI和聚醚组成多层涂层,亲水性的绒毛涂层(fuzzy)和联锁聚醚涂层[6].
3. 凝胶柱和无胶筛分
   CGE的**是毛细管凝胶柱的制备,常用聚丙烯酰胺凝胶栓来进行DNA片段分析和测序.测定蛋白质和肽的分子量常用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺电泳(SDS-LPAGE).如将聚丙烯配胺单体溶液中的交联剂甲叉双丙烯酰胺(Bis)浓度降为零,得到线性非交联的亲水性聚合物用作操作溶液,仍有按分子大小分离的作用,称无胶筛分.此法简单,使用方便,分离能力比CGE差.
4. 毛细曾填充往等
    CEC填充柱已在前面论述.也有将核糖核酸酶,己糖激酶,腺苷脱氨酶等固定到
毛细管表面,构成一开管反应器,再和CE连接,可进行核酸选择性检测,微量在线合成和分离寡核昔酸等工作.另一有意义的工作是用各种方式在毛细管内缓冲液中形成各种梯度,如PH梯度,溶剂浓度梯度等,来提高分离效率和选择性.

五, 毛细管电泳检测技术

     CE对检测器灵敏度要求相当高,故检测是CE中的**问题.迄今为止除了原子吸收光谱与红外光谱末用于CE外,其它检测手段均已用于CE.现选择重要的几类检测器介绍其**新进展.
1. 紫外检测器(UV)
    UV检测器集中在提高灵敏度,如采用平面积分检测池,这种设计可使检测光路增加到1cm[26].也有用光散射二极管(LEDS)作光源,其线性范围和信噪比优于汞灯.总体来说进展不大.
2. 激光诱导荧光检测[LIF]
    LIF是CE**灵敏的检测器之一,极大地拓展了CE的应用,DNA测序就须用LIF,单细胞和单分子检测也离不开LIF.LIF不但提高了灵敏度,也可增加选择性,缺点在于被测物须用荧光试剂标记成染色.利用CE-LIF技术可检出染色的单个DNA分子,向癌症的早期诊断及临床酶和**学检测等方向进行.CE/LIF向三个方向发展:在原有氦—镉激光器(325nm)和氩离子激光器(488nm)之外,发展价廉,长波长的二极管激光器;发展更多的荧光标记试剂来扩展应用面;开展更多的应用研究.CE/I'IF和微透析结合可测定脑中神经肽.采用波长分辨荧光检测器可提供有关蛋白和DNA序列的一些结构和动态信息[27].一些适用于二极管激光器的荧光标记试剂如CY—5等,正在不断开发和应用.
3. CE/MS联用
    将现在**有力的分离手段CE和能提供组分结构信息的质谱联用,弥补了CE定性鉴定的不足,故发展特别快.CE/MS联用主要在两方面发展:一是各种CE模式和MS联用,二是CE和各种MS联用.**是解决接口装置.成功地应用到CE/MS接口中.