变性梯度凝胶电泳(DGGE)原理

如果 DNA 双链分子全长不断增加温度或用化学变性剂处理,两条链就会开始分开(解链)。**先解链的区域由解链温度较低的碱基组成。 G.C 碱基对比 A.T 碱基对结合得要牢固,因此 G. C 含量高的区域具有较高的解链温度。同时影响解链温度的因素还有相邻碱基间的吸引力(称作“堆积”)。解链温度低的区域,通常位于端部称作低温解链区( lower melting domain )。如果端部分开,那么双螺旋就由未解链部分束在一起,这一区域便称作高温解链( high melting domain ) 。如果温度或变性剂浓度继续升高,两条链就会完全分开。变性梯度凝胶电泳法依据**要的一点是: DNA 双链末端一旦解链,其在凝胶中的电泳速度将会极剧下降。第二个根据是,如果某一区域**先解链,而与其仅有一个碱基之差的另一条链就会有不同的解链温度,因此,将样品加入含有变性剂梯度的凝胶进行电泳就可将二者分开。**终,如果一双链在其低温解链区碱基错配(异源双链),而与另一等同的双链相比差别仅在于此,那么,含有错配碱基的双链将在低得多的变性剂浓度下解链。事实上,样品通常含有突变、正常的同源双链以及配对的异源双链,后者是在 PCR 扩增加时产行的。而含有错配的双链通常可以远远地与两个同源双链分开,这种分离效果使该方法灵敏度很高。
  为使仅有一个碱基之差的不同分子取得**好的分离效果,**先选择所要研究的 DNA 范围以及电泳样品时变性剂浓度梯度。这可以正交变性梯度实验进行经验性的解决。变性剂梯度应选在曲线斜率大的部分,因为这时多数分子处于部分变性状态这使得落入低温解链区的不同分子达到**佳分离。
  为防止对患者样品分析之前对目标 DNA 片段的经验性分析占去大量时间,已在本技术的改进人 Leonard Lerman 的实验室设计了一项计算机程序,程度名叫 MELT87 和 SQHTX ,它可以模拟和任何已知序列 DNA 解链温度有关的解链行为。以碱基序列为基础,程序可以给出解链图象。作为实例血红蛋白基因的解链图。程序还可给出**佳凝胶电泳时间以及任何碱基改变对解链图象产生的预期影响。 MELT87 程序还可以决定是否将多聚 GC 加到 3’ 或 5’ 端的引物上。
  现在多数分析是用所谓的“ GC 夹板”( clamp )技术进行的(见下文)。它是将一段长度为 30-50 碱基,富含 GC 的 DNA 附加到双链的一端以形成一个人工高温解链区。 这样,片段的其他部分就处在低温解链区从而可以对其进分析。这一技术使该方法可检测的突变比例大大增加。