如何监控转膜的效率呢?

在早期,鄙人亦依据分子克隆的介绍,采用立春红染膜。只是后来发现此操作不仅增加额外的操作时间,而且不能说明任何问题,于是抛弃之。首先,立春红(也包括考染胶)的灵敏

度和HRP-ECL体系的灵敏度相差太远,即使立春红染膜无颜色,也无法提示WB结果会不会失败(考染胶无颜色也不能说明转膜充分了,除非你银染),你仍然得继续后面的操作;相反靶蛋白区域有颜色,亦无法提示靶蛋白就转膜完全了,也许只是另外一个分子量大小相近的蛋白。因此,无论立春红染膜失败或成功,你都必须进行后续的操作。而立春红染胶不仅增加额外的操作时间,而且增加一轮漂洗的操作,对膜和膜上的蛋白都不好。那么为什么不采用更直观的预染marker做转膜监控的依据呢?理论上,同时转膜、颜色是交联到蛋白上的,因此颜色有多深表明有多少蛋白转印到膜上,非常直观、不会增加任何额外的操作(固定marker的上样量非常必要)。当然上面提到针对PVDF膜,由于对小分子截留的局限,颜料分子会在高强度的转印过程中从交联的蛋白上脱落并穿过膜(颜料与蛋白交联得过深会使整个lane糊掉;太紧(多)可改变蛋白构象使迁移率改变。所以多数情况下颜料和蛋白之间是一种不稳定的交联,这意味着在某些条件下,颜料会从交联的蛋白上脱落,又因为膜分子孔径以及膜对不同物质吸附能力的差异,颜料小分子会轻易穿过膜到滤纸背面,而蛋白则被牢固的截留在膜上),造成转膜过度的假象。现在你知道有这种局限,要么更换NC膜;要么采用上面提到的非常稳定的转膜条件、注意必要的细节,就可从根本上忽略掉其对转膜效率的指示,而把预染的marker仅仅作为一个分子量大小的指针,当然同时可确认之前的转膜操作无误(没有插反电极,放反膜),也可为后续抗体孵育操作时膜的正反面做必要的提示。

不同公司预染的marker效果不太相同,一般NEB和invitrogen的常规分子量预染marker要上8-10ul,MBI的只要5ul(胶大小20×30cm),Biorad-mini3型(8.2×7.4cm)MBI**低2.5ul转膜后就足够清晰。

WWW.LIUYI17.COM Corporation of China 2010北京六一仪器厂电泳仪电泳槽凝胶成像系统电泳仪电源 公司简介 联系我们

客服电话
  • 15157563004
  • 15157564050