电泳操作方法简述

一、 目的 
建立SDS-PAGE电泳的测定方法,确保电泳检测的准确性,保证电泳的安全性、有效性。  
二、 范围与权责 
适用于本公司的所有成品以及中间体的分析,由化验员负责采样检测。 品控主管负责审核。  
三、 原理 
SDS-PAGE电泳,是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS,SDS会与变性的多肽结合,并使蛋白带负电荷,由于多肽结合SDS的量总是与多肽的分子量成正比而与其序列无关,因此SDS多肽复合物在丙烯酰胺凝胶电泳中的迁移率只与多肽的大小有关,在达到饱和的状态下,每克多肽可与1.4g去污剂结合。当分子量在15KD到200KD之间时,蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系,符合下式:lgMw=k-bX。式中:Mw为分子量;X为迁移率;k、b均为常数,若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对数分子量对数作图,可获得一条标准曲线,未知蛋白质在相同条件下进行电泳,根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。  
四、 实验仪器及试剂 
1. DYCZ-24DN 双垂直电泳仪 2. DYY-8C  电泳仪电源 
3. STS-2A  脱色摇床(水平) 4. 标准蛋白Marker 5. 平皿:直径150mm 6. TEMED:四甲基乙二胺 7. DTT:二硫苏糖醇 8. 
储存液 
①2M Tris-HCl缓冲液:称取24.2g Tris,用50ml蒸馏水溶解后,滴加HCl调节pH**8.8,待室温,加蒸馏水**100ml。 
②1 M Tris-HCl缓冲液:称取12.1g Tris,用50ml蒸馏水溶解后,滴加HCl调节pH**6.8,待室温,加蒸馏水**100ml。 
③10%SDS溶液:称取10g SDS ,加蒸馏水溶解**100ml。 ④50%甘油:50ml甘油加50ml蒸馏水,混合均匀。 
⑤1%溴酚蓝:100mg溴酚蓝,加蒸馏水**10ml,搅拌**完全溶解,水相针式过滤器过滤除去聚合的染料。 9.   工作液 
①A液:30%丙烯酰胺储存液,丙烯酰胺是一种神经毒素,可通过皮肤被人体吸收并富集。操作时要避免皮肤接触,并带合适的口罩于通风橱中进行。 
②B液—分离胶缓冲液:取75ml 2M Tris-HCl缓冲液,4ml10%SDS溶液,加21ml蒸馏水,混合均匀,4℃保存数月。 
③C液—浓缩胶缓冲液:取50ml 1M Tris-HCl缓冲液,4ml10%SDS溶液,,加46ml蒸馏水,混合均匀,4℃保存数月。 
④10%APS:称取1g过硫酸铵,加10ml蒸馏水溶解后,水相针式过滤器过滤分装到EP管中,4℃保存一个月,-20摄氏度保存一年。 ⑤上样缓冲液:称取0.154g DTT,于10ml容量瓶中,加少量水溶解后,加 0.6ml 1 M Tris-HCl缓冲液,5ml 50%的甘油,1ml 1%溴酚蓝,混合均匀后定容**刻度线。 
可分装**EP管保存,4℃保存一个月,-20摄氏度保存一年。 
⑥电极缓冲液:称取3g Tris,14.4g Gly,1g SDS**1L烧杯中,加1L蒸馏水溶解,搅拌均匀,室温保存。 
10.   染色液:称取1g考马斯亮蓝R-250,加450ml乙醇,加100ml乙酸,加水450ml,混合均匀,室温保存。 
11.   脱色液:100ml乙醇,加100ml冰醋酸,加水800ml,混合均匀,室温保存。  
五、 操作步骤 
1、电泳仪的组装 
   ①将平板玻璃和凹板玻璃重叠,用手将两块玻璃板在桌面上或是玻璃板上竖起,使两玻璃底面平齐,从而形成胶室。 
   ②将胶室放入主体,是凹玻璃的一面向内。若做单面胶,另一侧用单胶堵板(δ=5mm)代替。    ③插入楔形插板,用力向下按,挤紧玻璃板。 
   ④将主体放入原位制胶器内,手柄起立位与底座箭头对齐,两手同时把手柄向主体推动,直到推不动为止,然后开始旋转手柄,听到咔、咔两声,底座箭头指向手柄1.0mm标志处,此时楔形插板已压紧胶室,可以开始灌胶了。 2、分离胶的配制 
按上表,将A液,C液,蒸馏水先加到小烧杯中,混合均匀,再添加10%APS,TEMED后,混合均匀,迅速连续灌到分离胶顶部,直**有胶溢出,随即插入试样格,在室温或恒温箱内垂直放置10min,静置直**完全聚合。 4、样品的处理 
   将样品与上样缓冲液以4:1混合均匀,在金属浴上100℃,10min,如有沉淀,可适当离心备用。 5、加样 
   ①在凝胶聚合后,向相反的方向拧手柄,手柄弹出。        ②将电泳仪主体从原位制胶器上取出放入电泳仪下槽中。 
   ③将约140ml的电泳缓冲液倒入由胶室和主体形成的上槽中,使缓冲液没过凹玻璃板。 
④将约200ml的电泳缓冲液倒入下槽中 ⑤慢慢地将试样格垂直拔出。 
⑥将处理好的标准蛋白和待测蛋白样品,按预定顺序通过缓冲液小心的添加5~10μl到每个样品孔中。 6、电泳 
盖好电泳槽盖,接通电泳仪电源与电泳仪之间的电泳导线,设定电压为60V,电泳时间约为30min,直**溴酚蓝指示带经过浓缩胶与分离胶的分界线后,设定电压100v,电泳时间150min,直**溴酚蓝指示带接近分离胶底部,切断电源,电泳完毕。 7、剥胶 
       卸下电泳胶板,用刮刀小心撬开玻璃板,使两者分离,切除凝胶左下角以示标记。 
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