SDS-PAGE电泳标准操作流程介绍

3.程序: 
3.1. 制胶 
3.1.1组装胶架   将洁净、无水的玻片对齐,形成空腔,插入塑料框的凹槽中,注意箭头向上,并确保下
端平齐。放于制胶架上夹紧,下端紧贴密封条。 
3.1.2 分离胶的配置     
3.1.2.1  10%分离胶配方如下表:

3.1.2.2 灌胶  混匀后用移液枪将凝胶溶液沿玻棒小心注入到长、短玻璃板间的狭缝内(胶高度距样品模板
梳齿下缘约1cm)。  
3.1.2.3液封  在凝胶表面沿短玻板边缘轻轻加一层水以隔绝空气,使胶面平整。静置约30min观察胶面
变化,当看到水与凝固的胶面有折射率不同的界限时,表明胶已完全凝固,倒掉上层水,并用滤纸吸干残留的水液。 
3.1.3浓缩胶的配置   
3.1.3.1  5%浓缩胶配方下表:

3.1.3.2插入制胶梳  
混匀后用移液枪将凝胶溶液注入到长、短玻璃板间的狭缝内(分离胶上方),轻轻加入样品模板梳,小心避免气泡的出现。约30分钟,聚合完全。 3.2. 电泳 
3.2.1 安装电泳槽  将制备好的凝胶板取下,小心拔下梳子。两块10%的凝胶板分别插到U形橡胶框的两边凹
形槽中,可往上提起使凝胶板紧贴橡胶。将装好玻璃板的胶模框平放在仰放的贮槽框上,其下缘与贮槽框下缘对齐,放入电泳槽内。倒入1X tris-gly电泳缓冲液。 
3.2.2  样品处理  对于蛋白样品直接取80µl的样品,依次加上20µl  5x buffer (加了B-巯基乙醇),混匀。
对于菌体或组织等固体样品,取少量样品加100ul 2x buffer (加了B-巯基乙醇)煮沸10分钟。 
3.2.3  加样    用移液枪取处理过的样品溶液10μl,小心地依次加入到各凝胶凹形样品槽内,marker 加
入到其中一个槽内,为区别两块板,marker可加在不同的孔槽中。 
3.2.4 电泳  将电泳槽放置电泳仪上,接通电源,正负极对好。电压调至约150v保持恒压。待溴酚蓝标记移动到凝胶底部时,关电源,把电泳缓冲液倒回瓶中。 
3.2.5剥离胶  把电泳槽取出,两块板拿下来,用刮片从长短玻片中间翘起,再把浓缩胶刮掉,取下。 
3.3. 染色放于加有R250染色液的染色皿中,染液漫过胶即可,置于摇床上,转速约为45r/min,时间约1小时,
完成后染液倒掉并用水洗掉染液。 
3.4.脱色取出染色过的胶放于加有脱色液的染缸里,脱色液漫过胶即可,置于摇床上,转速约为45r/min,时间约1小时,本底色脱净,条带清晰可见即可,完成后倒掉脱色液。 
3.5.拍照  将脱色后的胶置于透明文件夹中,把胶上面的气泡赶出(用前也可用酒精棉球擦干净文件夹),放到
扫描仪上,拍照。 
4. 注意事项 
4.1  根据目的蛋白的大小选择合适的胶片浓度。一般为100KD-50KD选用10%胶;50KD-30KD选用12%胶;
30KD-10KD选用15%胶。4.2  要根据样品浓度来加样品溶解液。每加一个样品后换一支吸头或清洗吸头后再点另一个样品。4.3  制备聚丙烯酰胺凝胶时,倒胶后常漏出胶液,那是因为二块玻璃板与塑料条之间没封紧,留有空隙,所以这步要特别留心操作.4.4  电泳完毕撬板取凝胶时要小心细致不能把胶弄破。 4.5  电泳缓冲液可重复利用,如果胶上出现不正常痕迹,就要及时更换新液。4.6  分离胶高度控制得当,确保有大约1cm左右的浓缩胶空间。过长或过短均不能得到理想的电泳结果。4.7  电泳染色液注意进行回收再利用,一般可重复使用2-3次。4.8 AP和TEMED是催化剂,加入的量要合适,过少则凝胶聚合很慢甚至不聚合,过多则聚合过快,影响倒胶。
操作步骤: 
采用垂直式电泳槽装置 1、 安装电泳槽 
2、 配制分离胶(12%)(10ml): 

将分离胶上的水倒去,并用滤纸吸干多余水份,加入上述混合液,立即将梳子插入玻璃板间,完全聚合需15-30min。 4、待积层胶完全聚合后,小心拔出梳子,然后将玻璃板固定在电泳槽上。 
5、样品处理:将样品加入等量的2×SDS上样缓冲液,100℃加热3-5min, 12000g离心1min,取上清作SDS-PAGE分析,同时将SDS低分子量蛋白质Marker作平行处理。 
6、上样:取10μl诱导与未诱导的处理后的样品加入样品池中,并加入20μl低分子量蛋白Marker作对照。 
7、电泳:在电泳槽中加入1电泳缓冲液,连接电源,电泳时,积层胶电压80V,分离胶电压120V,电泳至溴酚蓝行至电泳槽下端停止(约需2-3h)。 
8、染色:将胶从玻璃板中取出,置于考马斯亮蓝染色液中染色,室温4-6h。 9、脱色:将胶从染色液中取出,放入脱色液中,多次脱色至蛋白带清晰。 
客服电话
  • 15157563004
  • 15157564050