DNA的琼脂糖凝胶电泳实验原理和操作步骤简述

一、试验意图 
琼脂糖凝胶电泳是常用的检查核酸的办法,学习DNA琼脂糖凝胶电泳的运用技能,掌握有关的技能和识读电泳图谱的办法。 二、试验原理 
琼脂糖凝胶电泳是常用的用于别离、鉴定DNA、RNA分子混合物的办法,这种电泳办法以琼脂凝胶作为支持物,运用DNA分子在泳动时的电荷效应和分子筛效应,到达别离混合物的意图。DNA分子在高于其等电点的溶液中带负电,在电场中向阳极移动。在一定的电场强度下,DNA分子的搬迁速度取决于分子筛效应,即分子自身的巨细和构型是首要的影响要素。DNA分子的搬迁速度与其相对分子量成反比。不一样构型的DNA分子的搬迁速度不一样。如环形DNA分子样品,其中有三种构型的分子:共价闭合环状的超螺旋分子(cccDNA)、开环分子(ocDNA)、和线形DNA分子(IDNA)。这三种不一样构型分子进行电泳时的搬迁速度巨细次序为:cccDNA>IDNA>ocDNA 
核酸分子是两性解离分子,pH3.5是碱基上的氨基解离,而三个磷酸基团中只要一个磷酸解离,所以分子带正电,在电场中向负极泳动;而 pH8.0-8.3时,碱基几乎不解离,而磷酸基团解离,所以核酸分子带负电,在电场中向正极泳动。不一样的核酸分子的电荷密度大致一样,因而对泳动速度影响不大。在中性或碱性时,单链DNA与等长的双链DNA的泳动率大致一样。 
影响核酸分子泳动率的要素首要是: 1、样品的物理性状 
即分子的巨细、电荷数、颗粒形状和空间构型。通常而言,电荷密度愈大,泳动率越大。可是不一样核酸分子的电荷密度大致一样,所以对泳动率的影响不明显。 
对线形分子来说,分子量的常用对数与泳动率成反比,用此规范样品电泳并测定其泳动率,然后进行DNA分子长度(bp)的负对数——泳动间隔作规范曲线图,能够用于测定不知道分子的长度巨细。 
DNA分子的空间构型对泳动率的影响很大,比方质粒分子,泳动率的巨细次序为:cDNA>IDNA>ocDNA可是因为琼脂糖浓度、电场强度、离子强度和溴化乙锭等的影响,会呈现相反的状况。 2、支持物介质 
核酸电泳通常运用琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶两种介质,琼脂糖是一种聚合链线性分子。含有不一样浓度的琼脂糖的凝胶构成的分子筛的网孔巨细不一样,是于别离不一样浓度规模的核酸分子。聚丙烯酰胺凝胶由丙烯酰胺(Acr)在N,N,N′-四甲基乙四胺(TEMED)和过硫酸铵(AP)的催化下聚合形生长链,并经过交联剂N,N′-亚甲双丙烯酰胺(Bis)穿插衔接而成,其网孔的巨细由Acr与Bis的相对份额决议。 
琼脂糖凝胶合适别离长度100至60的分子,而聚丙烯酰胺凝胶关于小片段(5bp-500bp)的别离作用最佳。挑选不一样浓度的凝胶,能够别离不一样巨细规模的DNA分子。 3、电场强度 
电场强度愈大,带点颗粒的泳动越快。但凝胶的有用别离规模跟着电压增大而减小,所以电泳时通常选用低电压,不超越4V/cm。而关于大片段电泳,乃至用0.5-1.0V/cm电泳过夜。进行高压电泳时,只能运用聚丙烯酰胺凝胶。 4、缓冲液离子强度 
核酸电泳常选用TAE、 TBE、TPE三种缓冲体系,但它们各有利弊。TAE价格低廉,但缓冲才能低,必须进行南北极缓冲液的循环。TPE在进行DNA收回时,会使DNA污染磷酸盐,影响后续反响。所以多选用TBE缓冲液。 
在缓冲液中参加EDTA,能够鳌合二价离子,按捺DNase,维护DNA。 缓冲液pH常偏碱性或中性,此刻核酸分子带负电,向正极移动。 
核酸电泳中常用的染色剂是溴化乙锭(ethidium bromide EB)。溴化乙锭是一种扁平分子,能够嵌入核酸双链的配对碱基之间。在紫外线照耀BE-DNA复合物时,呈现不一样的效应。254nm的紫外线照耀时,灵敏度最高,但对DNA损害严峻;360nm紫外线照耀时,尽管灵敏度较低,但对DNA损害小,所以合适对DNA样品的调查和收回等操作。300nm紫外线照耀的灵敏度较高,且对DNA损害不是很大,所以也对比适用。 

WWW.LIUYI17.COM Corporation of China 2010北京六一仪器厂电泳仪电泳槽凝胶成像系统电泳仪电源 公司简介 联系我们

客服电话
  • 15157563004
  • 15157564050