什么是凝胶电泳?

电泳是实验室中常用的一种技术,用于根据大小分离带电分子,例如DNA。

  • 凝胶电泳是实验室中常用的一种技术,用于分离带电分子,例如DNA ?,RNA ?和蛋白质?根据它们的大小。
  • 当电流通过凝胶时,带电分子穿过凝胶。
  • 在凝胶上施加电流,以使凝胶的一端带正电荷,而另一端带负电荷。
  • 带电分子的运动称为迁移。分子向相反电荷迁移。因此,带负电荷的分子将被拉向正末端(相反的方向吸引!)。
  • 凝胶由可渗透的基质(有点像筛子)组成,当电流通过时,分子可以穿过该基质。
  • 较小的分子在凝胶中的迁移速度更快,因此比较大的分子迁移速度更慢,因此迁移距离更短,因此较大的分子可以迁移。结果,分子按大小分开。

凝胶电泳和DNA

  • 电泳使您能够区分不同长度的DNA片段。
  • DNA带负电,因此,当电流施加到凝胶上时,DNA会向带正电的电极迁移。
  • 较短的DNA链比较长的DNA链穿过凝胶的速度更快,从而导致片段按大小顺序排列。
  • 使用染料,发荧光?标签还是放射性的?标记使分离后的凝胶上的DNA可见。它们将在凝胶上显示为条带。
  • 具有已知长度片段的DNA标记通常与样品同时在凝胶中穿行。
  • 通过将DNA样品的条带与DNA标记的条带进行比较,可以算出样品中DNA片段的大致长度。

凝胶电泳如何进行?

准备凝胶

  • 琼脂糖凝胶?通常用于可视化DNA片段。用于制作凝胶的琼脂糖浓度取决于您正在使用的DNA片段的大小。
  • 琼脂糖浓度越高,基质越致密,反之亦然。较小的DNA片段在较高浓度的琼脂糖上分离,而较大的分子需要较低浓度的琼脂糖。
  • 为了制备凝胶,将琼脂糖粉与电泳缓冲液混合并加热至高温,直到所有琼脂糖粉融化为止。
  • 然后将熔化的凝胶倒入凝胶浇铸盘中,并在一端放置一个“梳子”,以制成用于移液的孔。
  • 凝胶冷却并固化后(现在将是不透明而不是透明的),将梳子移开。
  • 现在,许多人都使用预制的凝胶。
  • 然后将凝胶放入电泳槽中,并将电泳缓冲液倒入槽中,直到覆盖凝胶表面为止。缓冲器传导电流。所用缓冲液的类型取决于样品中DNA片段的大致大小。

准备用于电泳的DNA

  • 在电泳之前将染料添加到DNA样品中,以增加样品的粘度,这将防止其浮出孔,从而可以看到样品通过凝胶的迁移。
  • 将DNA标记物(也称为大小标准品或DNA阶梯)装入凝胶的**个孔中。标记中的片段长度已知,因此可用于帮助估计样品中片段的大小。
  • 然后将制备的DNA样品吸移到凝胶的其余孔中。
  • 完成此操作后,将盖子放在电泳槽上,确保凝胶以及正负电极的方向正确(我们希望DNA跨凝胶迁移至正端)。

分离碎片

  • 然后打开电流,使带负电荷的DNA穿过凝胶向凝胶的正侧移动。
  • 较短长度的DNA移动的速度快于较长长度的DNA,因此在运行电流时移动的距离更远。
  • DNA迁移到凝胶中的距离可以通过监视上样缓冲液染料的迁移来直观判断。
  • 留下的电流要足够长,以确保DNA片段在凝胶上移动的距离足以将它们分开,但不要过长以至于它们从凝胶末端流出。
用于按大小分离DNA片段的DNA电泳设备插图。 凝胶位于缓冲罐中。 将DNA样品置于凝胶一端的孔中,并且电流流过凝胶。 带负电荷的DNA向正电极移动。 图片来源:Genome Research Limited

用于按大小分离DNA片段的DNA电泳设备插图。凝胶位于缓冲罐中。将DNA样品置于凝胶一端的孔中,并且电流流过凝胶。带负电荷的DNA向正电极移动。图片来源:Genome Research Limited

可视化结果

  • 一旦DNA在凝胶上迁移足够远,就将电流切断,并将凝胶从电泳槽中移出。
  • 为了使DNA可视化,用与DNA结合的荧光染料对凝胶进行染色,然后将其放在紫外透射仪上,该透射仪将被染色的DNA显示为亮带。
  • 或者,染料可以在倒入之前与凝胶混合。
  • 如果凝胶正确运行,将可见DNA标记物/大小标准品的条带模式。
  • 然后可以通过想象一条横穿DNA标记带的水平线来判断样品中DNA的大小。然后,您可以通过将它们与标记中**接近的条带进行匹配来估计样品中DNA的大小。

显示脱氧核糖核酸带的例证在凝胶分离了。将DNA片段的长度与包含已知长度的片段的标记进行比较。