如何分析电泳

在凝胶电泳仪中,DNA或蛋白质样品的分离(通常基于大小)是通过施加电场使它们迁移通过凝胶来分离的。凝胶电泳在生物医学研究实验室中是常规操作,可用于回答各种不同的问题,因此,实际上并没有一种通用的方法来分析结果。

例如,诸如蛋白质印迹,RNA印迹和DNA印迹的不同技术都涉及凝胶电泳。

如果您要进行DNA样品的琼脂糖凝胶电泳(**常见的一种方法),通常需要至少做两件事:1)区分未切割的质粒与插入片段,带切口的质粒和切割的质粒,以及2)估计使用标准曲线Excel或计算器计算各种DNA片段的大小。

运作方式如下。

检查您的实验室笔记本以确定哪些样品已装入哪些通道。当装载凝胶孔时,您应该注意每个泳道/样品的身份。

确定哪个泳道包含DNA标准的“阶梯”。这些是已知长度的片段。它们的迁移距离可用于通过标准曲线Excel或其他计算器确定样品片段的大小。

用尺子测量从孔到跟踪染料的图像距离,该染料比任何DNA条带都行进的距离远(换句话说,它将位于凝胶的底部)。记录此数字-您使用的单位并不重要。

测量照片上从孔到“阶梯”中每个带的距离,然后用该距离除以跟踪染料带所经过的距离。此计算为您提供每个频段的相对迁移率。

示例:假设跟踪染料带移动了6英寸,而我们有三个带移动了5、4.5和3.5英寸。

他们的相对流动性是什么?答:我们将5、4.5和3.5除以6得到的相对迁移率分别为0.833、0.75和0.5833。

将相对迁移率输入到电子表格程序(Excel或您使用的任何其他类似程序)中,并将阶梯中每个片段的大小(以千碱基为单位)一起输入。

制造商会为您提供他们提供的梯子中每个碎片的大小,因此您应该已经有了此信息。

在x上绘制具有相对移动性的数据,在y上绘制以千为单位的大小的数据。

在电子表格程序上使用趋势线函数将方程拟合到数据中。该方程式应为幂方程式(例如x ^ -2),并且应相对较好地拟合数据(R系数至少为0.9)。这将创建一条曲线和一个标准曲线Excel。

查看与您的样本相对应的谱带。

请记住,较小的DNA片段比较大的DNA片段穿过凝胶的距离更远,因此**靠近跟踪染料的片段将**小。但是请注意,如果未切割质粒(环状)DNA,它将像电话线一样“超螺旋”或扭曲,这实际上会使它比相同大小的线性DNA 传播得更远。

同样,未完全切割的“切口”质粒将比相同大小的线性DNA 传播更短的距离。因此,您无法从凝胶中估计未切割质粒的大小。

将每个泳道中的条带与您在该泳道中加载的样品的标识相匹配,并确定您所看到的是否是您所期望的。这将取决于实验的性质。

但是,一般来说,如果您用两种限制性酶消化插入质粒,则可以预期该插入物中将没有质粒。

由于它比质粒小得多,您可能会在该泳道中看到两条带,一条靠近顶部,而另一条靠近底部。仅用一种限制酶切割的质粒应仅形成一条条带,该条带比用两种限制酶切割的质粒行进的距离要远一些,但不能远至插入片段。

测量从孔到切出的质粒的距离,并用尺子插入条带。将这些数字除以跟踪染料的行进距离,即可得出插入片段和切割质粒的相对迁移率。

将插入片段和剪切质粒的相对迁移率插入电子表格程序为您计算的方程式中。这种计算应给您估计这些质粒的大小。