western blot五年体会——“穷人的劳斯莱斯”

题记:本文转载自丁香园论坛热贴:“穷人的劳斯莱斯”,作者seagate分享了他在从2005年**次见到抗体到2010年间五年western blot的实验经历。五年里,太多的磨难,太多的惊喜,太多的感触,太多的代价,让seagate对于western blot实验有了独到深刻的见识。因为论坛排版不佳,转载全文**此,以飨各位网友。再次向丁香园网友seagate致以诚挚的谢意。

1、抗体的选择

     对于国内的大多数实验室来讲,做western blot实验选择抗体是个头疼的问题。原因很简单,买进口抗体捉襟见肘,买国产抗体得需要大无畏的勇气,对于我所在的兰州地区的实验者而言,感触尤深。在这五年的western blot实验历程里,我先后用过进口抗体,进口抗体国内分装包装,国产抗体,质量良莠不齐。

     进口抗体一般不会出现闪失:abcam品种全,质量过硬,但价高(3400元/100微升),而且说是100微升,但**多能吸出来90微升;Sigma的价**贵;比较有性价比的是CST的抗体,现在好像是2200元/100微升,我前后用过二十几种, 1:1000的稀释比下,还没有失过手,100微升通常能完成所有的免疫组化和western blot实验,还有一个优点是通常量比100微升多出来10微升,**的不足是CST的品种实在不多。Santa的多克隆抗体质量可以,但是选用Santa的单抗还是有风险,估计这也是业界共识了吧。

     进口抗体国内分装包装我也用过不少,呵呵,毕竟是穷人(420元/100微升),大概好抗体的比例约为50%,如果能做出来,也存在一个问题,就是抗体大多只能用一次。我曾经把Santa的原装抗体和分装抗体做过比对(抗体品种,货号等完全一致),在都能做出来的前提下,原装抗体能重复使用的次数要多出许多。具体原因我已经揣测了好几年,不敢说出来,我一直在想是不是冬天西瓜切成牙和整个卖,也会有所不同。揣测归揣测,假如只为了发论文毕业走人,可以考虑选用进口分装的多克隆抗体。

     国产抗体比较知名的就几家,但质量确实不敢恭维。western blot能做出来的确实不多,而且杂带多,背景不干净。我们周边的实验室大多买国产抗体做免疫组化,怎么说呢,应付硕士论文够了。

     我也帮别人自制过抗体,再用抗原亲和纯化。效价非常不错,夸张的时候1:10000都能做出条带,**的麻烦是兔子太骚(骚臭),不知道这是不是“兔女郎”名号的来由。如果读书非常悠闲,老板又特别想拥有手工作坊的情况下,可以自己伺候折腾兔子来玩玩,刚开始的时候还是蛮有成就感的。只是单凭抗原表达和制备多抗,是不是可以写成论文毕业,估计因校而异了。

     2、Western Blot设备

     目前**好的垂直槽和转移槽还是Biorad(伯乐),尤其是MINI3好用,MINI4可以一次跑四块胶,但通常用不上,由此造成垂直缓冲液的浪费,而且MINI4用绿色塑料夹住玻璃板来组成内槽,容易漏液,塑料夹应该是有疲劳寿命的,估计日子一长,弹性就会改变,所以如果你们实验室刚买了MINI4,赶紧用,遭殃的肯定是某一级的师弟师妹们。

     Biorad的一套系统得两万多,西部能玩得起伯乐的还真不多。好在咱中国人聪明,上海天能的外观和构造和伯乐的MINI3几乎一模一样,而且可以通用,不带电泳仪是5千多一套,挺好用的。**的不足是塑料寿命不如伯乐,胶架容易断裂。不过仔细算算,三套天能也就是一套伯乐的价格,值了。北京六一的垂直槽很转移槽很好用,但垂直槽配胶不方便,玻板太厚,散热不好,但能用,六一的电泳仪(电源)还是很好用的。

     3、Western Blot实验条件

     Western Blot实验条件我基本是按ABCAM公司经典教材做的,按以下的网址下载下来就可以了(http://www.abcam.com/ps/pdf/protocols/WB-beginner.pdf)。具体的试剂配方我是按宝生物试剂册的附录部分配制。丙烯酰胺和甲叉我是从北京华美买的德国biomol原装货,配出来的胶可以提在手里玩,弹性非常好,价格比sigma的便宜许多,1公斤好像是480多人民币,够实验室用好长时间,现在我们实验室做双向电泳都用biomol的胶,很好用。Marker我现在用fermantas 的SM1811,2微升就很清晰了,兰州的代理是上海生工。

     要强调的是垂直电泳缓冲液千万不能回收用,具体愿因你只需上网查查SDS-PAGE的原理就知道了。转移电泳缓冲液可以回收再用两次。

     转膜我通常是快转两百200毫安/2小时,慢转80毫安/12小时。快转是一定得做冰水浴,就是把槽子泡在冰水混合液里。

     封闭我通常用BD的脱脂奶粉,不归,260元500克,也是从北京华美买的。

     ECL我用pierce的,500毫升1650元,比国产的还便宜好用。

     胶片是柯达的,以前用过乐凯的,不如柯达。

     我很少用丽春红或考马斯染膜或染胶,总觉得是脱裤子***的事。

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