以PVDF膜为固相载体的半干转印法

【材料与试剂】

(1)         转印缓冲液

    Tris碱        48mmol/L             5.8g

    甘氨酸        39mmol/L             2.9g

    SDS           0.037% (w/v)          0.37g

    甲醇           20%                  200ml

    蒸馏水                         加**1000ml

(2)甲醇

(3)6张吸水纸(Whtaman 3 MM或类似物)和1张PVDF膜

(4)电转移装置

【操作步骤】

(1)用蒸馏水淋洗装置的平板电极;

(2)将凝胶切成适当大小用于转印。除去无关的凝胶和未使用的泳道。作好凝胶标记以确定**条泳道的方向。在准备滤纸时,将凝胶放入转印缓冲液中;

(3)剪取6张吸水纸(Whtaman 3 MM或替代物)和1张PVDF膜,使其稍大于凝胶,将PVDF膜浸泡在甲醇溶液中5分钟,操作时要戴手套。油污或其它蛋白质可阻碍蛋白质与PVDF膜结合。滤纸剪成适当大小。如果滤纸与凝胶的边缘重叠,电流将短路而绕过凝胶,使转印不能有效进行。一个可行的办法是以封口膜作为垫子绕在凝胶的周围将其与滤纸分开或膜的面积稍大于凝胶,使凝胶通过膜与滤纸分开;

(4)将吸水纸放入转印缓冲液中浸湿;

(5)将凝胶、PVDF膜和滤纸放在平板装置的底部,放置顺序如下:

-底部平板阳极

a.三层转印缓冲液浸湿的吸水纸

b.一张转印缓冲液浸湿的PVDF膜

c.用转印缓冲液稍微湿润的聚丙烯酰胺凝胶

d.三层转印缓冲液浸湿的吸水纸

-阴极

(6)仔细检查有无气泡,并用戴有手套的手或玻棒驱赶气泡,吸干凝胶-滤纸夹层组合旁边的缓冲液。许多装置在凝胶-滤纸夹层组合旁边有一个垫圈以防转印时发生短路;

(7)小心将电极插入装置顶部。接通电极(正极或红色表示阳极)并进行转印。以0.8mA/cm2 凝胶,转印45min**1.5h。转印时间不宜太长,否则易引起干胶;

(8)转印结束后立即断开电源,小心拆开装置,将膜做上标记。电极用后要用蒸馏水清洗。

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