Western Blot转膜

在电流的作用下,使蛋白质从胶转移**固相载体(膜)上。

膜的选择:印迹中常用的固相材料有NC膜、DBM、DDT、尼龙膜、PVDF等。我们选用PVDF(聚偏二氟乙烯),其具有更好的蛋白吸附、物理强度,以及具有更好的化学兼容性。 有两种规格:Immobilon-P(0.45um)和Immobilon-PSQ(0.2um for MW<20kDa)。

A 半干法

即将凝胶夹层组合放在吸有转印缓冲液的滤纸之间,通过滤纸上吸附的缓冲液传导电流,起到转移的效果。因为电流直接作用在膜胶上,所以其转移条件比较严酷,但是其转移时间短,效率高。

1 实验条件的选择

电流1mA-2mA/cm2,我们通常100mA/膜,按照目的蛋白分子大小、胶浓度选择转移时间,具体可以根据实际适当调整。

目的蛋白分子大小(kDa) 胶浓度 转移时间

80---140 8% 1.5-2.0

25---80 10 1.5

15--40 12 0.75

<20 15 0.5

2 实验操作

(1)滤纸和膜的准备 (在电泳结束前20分钟应开始准备工作)。

A. 检查是否有足够的transfer buffer,没有立即配制。

B. 检查是否有合适大小的滤纸和膜。

C. 将膜泡入甲醇中,约1-2分钟。再转入transfer buffer中。

D. 将合适的靠胶滤纸和靠膜滤纸分别泡入transfer buffer 中。

PDVF膜在进转移缓冲液时,要在甲醇里面泡多长时间?

PVDF是疏水性的,在转膜缓冲液里很难浸透,甲醇处理后使更容易浸润。 PVDF的预处理是用甲醇浸泡活化,浸泡透之后转入蒸馏水洗两次。用甲醇泡的目的是为了活化PVDF膜上面的正电基团,使它更容易跟带负电的蛋白质结合。

一般5-20分钟都有人在用。可在取胶的同时泡,估计前后5分钟左右。效果还不错。以前有站友发贴,说处理时间没多大关系,关键看膜的质量.确实是这样的。只要让膜完全浸透应该就没问题了。

Hybond的PVDF说明书这样的写的:“pre-wet the membrane in 100% methanol (10 seconds)”。 我的理解是,**少10秒钟,多泡下也没关系的,事实上,泡10秒的做过,10分钟的也做过,都没有问题的。

(2)转移

A. 在电转移仪上铺好下层滤纸。一般用三层。

B. 将膜铺在靠膜滤纸上,注意和滤纸间不要有气泡,再倒一些transfer buffer到膜上,保持膜的湿润。

C. 将胶剥出,去掉stack gel,小心的移到膜上。

D. 剪去膜的左上角,在膜上用铅笔标记出胶的位置。

E. 将一张靠胶滤纸覆盖在胶上。 倒上些transfer buffer,再铺两张靠胶滤纸。

F. 装好电转移仪,根据需要选定所需的电流和时间。

G. 转移过程中要随时观察电压的变化,如有异常应及时调整。

3 注意事项及常遇到的问题:

1)滤纸、胶、膜之间的大小,一般是滤纸>=膜>=胶。

2)滤纸、胶、膜之间千万不能有气泡,气泡会造成短路。

3)因为膜的疏水性,膜必须首先在甲醇中完全浸湿。而且在以后的操作中,膜也必须随时保持湿润(干膜法除外)。

4)滤纸可以重复利用,上层滤纸(靠膜)内吸附有很多转移透过的蛋白质,所以上下滤纸一定不能弄混,在不能分辨的情况下,可以将靠胶滤纸换新的。

5)转移时间一般为1.5 小时,( 1mA-2mA/cm2,10% gel),可根据分子量大小调整转移时间和电流大小。

1)在叠膜、胶、纸三明治时候,操作于盛有转膜Buffer的大平皿中进行,叠好后,再将三者平行转移**转膜装置,切勿再移动,因为在buffer中操作,已经完全排除了气泡存在的可能,无需再赶气泡

2)关于转膜时间:半干转的话,20 V×30min即可

B 湿法

我们基本上不用此方法,这里暂不做介绍。

C 转移后效果的鉴定

1.染胶

用考马斯亮兰染色经destain脱色后,看胶上是否还有蛋白来反映转移的效果。

2.染膜

有两类染液选择,可逆的和不可逆的。可逆的有ponceau-s red 、Fastgreen FC、CPTS等,这类染料染色后,色素可以被洗掉,膜可以用做进一步的分析用。但是不可逆的染料,如考马斯亮兰、india ink、Amido.black 10B等,染色后膜就不能用于进一步的分析。

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