WB 转膜条件推荐

Western 免疫印迹(Western Blot)是将蛋白质转移到膜上,然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白,可用相应抗体作为一抗进行检测,对新基因的表达产物,可通过融合部分的抗体检测。
 
为利于更好的实验效果,不同蛋白,转膜条件略有不同,今天跟各位同学一起分享下实验过程中发现的不同蛋白的转膜条件。
 
蛋白来源:RAW264.7 总蛋白
蛋白名称:一些转录因子
蛋白分子量:40~70 KD
WB 用膜类型、孔径:0.45 NC
转膜方式(恒压、恒流):湿转 恒流 400 mA
转膜时间:60~90 min
PS. 其实吧,以我的经验来看,除非目的蛋白特别小,或者特别大,不然转膜时间真的不是那么重要, 曾经因为失误,转了 15 min 就拆下来了,但从丽春红染色来看,跟平常实验也没有太大的区别。
 
蛋白来源:内皮细胞 总蛋白
蛋白名称:occludin & AKT
蛋白分子量:65 KD & 56 KD
WB 用膜类型、孔径:0.45 PVDF
转膜方式(恒压、恒流):湿转 恒压 100 V
转膜时间:60~70 min
设备名字是「Bio-Rad mini」。
 
蛋白来源:肿瘤手术标本
蛋白名称:转录因子
蛋白分子量:33 KDa
WB 用膜类型、孔径:PVDF 膜
转膜方式(恒压、恒流):350 mA 恒流
转膜时间:150 min
转膜设备:湿转 Bio-Rad
说明:相同条件曾用于数个 30-70 KDa 的蛋白,都能成功转上,不过没有试缩短时间效果如何; 实验时没为转膜条件苦恼,倒是电泳时胶的浓度及时间根据不同分子量而有区别。
 
蛋白来源:成纤维细胞
蛋白名称:smad3
蛋白分子量:54 KDa
WB 用膜类型、孔径:PVDF 膜
转膜方式(恒压、恒流):350 mA 恒流
转膜时间:150 min
转膜设备:湿转 Bio-Rad 
蛋白来源:肿瘤细胞
蛋白名称:磷酸化蛋白
蛋白分子量:10-200 KDa
WB 用膜类型、孔径:millipore PVDF 膜 0.45 um
转膜方式(恒压、恒流):120 v 恒压
转膜时间:120 min
转膜设备:湿转 Bio-Rad
建议:转膜缓冲液只用 2 次,基本都转上,5%BSA 封闭,减少背景。
 
蛋白来源:Hepg2
蛋白名称:EGFR
蛋白分子量:170kd
WB 用膜类型、孔径:pvdf 0.45
转膜方式(恒压、恒流):24V
转膜时间:2 个半小时
转膜设备:伯乐半干转
 
蛋白来源:肝癌细胞
蛋白名称:HIF-1α
蛋白分子量:120 kD
WB 用膜类型、孔径:NC 膜
转膜方式(恒压):80 伏,湿转
转膜时间:150 分钟
设备:「Bio-Rad mini」
建 议:湿转,转膜液特别重要,否则会导致电压或者电流不稳影响转膜条带。转膜均现配先用,不重复利用。转膜时间一般是 150 分钟,80 伏恒压。经李春红染 色,靠近蛋白胶的一侧膜上蛋白染色深,膜另外一面染色浅,说明蛋白未转过。该湿转条件自己做过的蛋白分子量范围:170-36 kD。
 
 
蛋白来源:肺脏
蛋白名称:ICAM-1
蛋白分子量:85~110 KD
WB 用膜类型、孔径:0.22NC
转膜方式(恒压、恒流):湿转 恒流 300 mA
转膜时间:120 min
设备名字 Bio-Rad mini
一抗用的 santa cruz 1 mL 包装的。 比例调整到 1:800 做出很好的条带。 效价会一直降低的。去年做的这个指标,今年夏天做就不行了。
 
蛋白来源:人肿瘤细胞
蛋白名称:磷酸化蛋白
蛋白分子量:30-60 KDa
WB 用膜类型、孔径:pall NC 膜 0.45 um
转膜方式(恒压、恒流):恒流 0.85-1 mA/平方厘米膜
转膜时间:60-90 min
转膜设备: 北京六一 半干转
建议:转膜缓冲液用新鲜配制的,可先配成 2 倍的母液,转膜液的多少会影响电转的效率,一般将吸水纸润湿即可,不要和膜一起浸泡,这样效果很好。
 
蛋白来源:人肝癌肿瘤细胞
蛋白名称:notch
蛋白分子量:60-120 KDa
WB 用膜类型、孔径:pall NC 膜 0.45 um
转膜方式(恒压、恒流):恒流 0.3 A
转膜时间:-20 度冰柜 120 min
转膜设备: 湿转 Bio-Rad
建议:转膜缓冲液用新鲜配制的,可先配成 10 倍或 5 倍的母液,保持低温是转膜效果的一个保证,这样效果很好。
 
蛋白来源:肺脏、肝脏等。
蛋白名称:actin
蛋白分子量:43 kD
WB 用膜类型、孔径:NC 膜 PALL 0.22 um
转膜方式(恒压、恒流):湿转 恒流 200 mA
转膜时间:45~60 min
设备名字 Bio-Rad mini
用的 santa cruz 分装和整装的都可以。效价一般 1:1000-1:3000 左右,可稳定较长一段时间。
 

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