WB 过程中常见问题及建议大汇总

Western 免疫印迹(Western Blot)是将蛋白质转移到膜上,然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白,可用相应抗体作为一抗进行检测,对新基因的表达产物,可通过融合部分的抗体检测。
 
WB 实验中常会出现各种问题,迪申生物技术(上海)有限公司专注于生产免疫组化相关产品多年,对 WB 实验有一定了解,今天跟各位同学一起分享下 WB 实验中各种问题及应用对策。

          问题                             可能原因                       建议
电泳条带成笑脸状 胶不均匀冷切,中间冷却不好,电泳系统温度偏高 减少电压减慢电泳速度,在冷室或者冰浴中进行电泳
电泳条带成皱眉状 可能是由于装置不合适,特别可能是凝胶和玻璃挡板底部有气泡,或者两边聚合不完全 调整装置
拖尾 样品溶解不好 样品充分溶解混匀后上样
纹理(纵向条纹) 样品中含有不溶性颗粒 样品充分搅拌混匀
条带偏斜 电极不平衡或者加样位置偏斜 调整电极和加样
条带两边扩散 加样量过多 适当减少上样量
Marker 变黑色 抗体和 Marker 蛋白反应 在 Marker 和 sample 之间空出一个孔不上样
背景高 膜封闭不够 延长封闭时间,选择**适宜的抗体稀释度
一抗稀释度不适宜 对抗体进行滴度测试,选择**适宜的抗体稀释度
一抗孵育的温度偏高 建议 4℃ 结合过夜
二抗浓度度过高 降低二抗浓度
二抗的非特异性背景 增加一个二抗对照,不加一抗,其他操作过程不变,即可验证背景是否是由于二抗所致。可选择其它二抗(特异性更强的,只针对重链)
二抗孵育时间过久 减少二抗孵育时间
选择膜的问题 硝酸纤维素的背景会比 PVDF 膜低
膜在实验过程中干过 实验过程中要注意保持膜的湿润
检测时曝光时间过长 注意曝光时间的缩短
洗膜不充分 增加洗膜的时间和次数
抗体和封闭蛋白有交叉反应 检测抗体与封闭蛋白的交叉反应性,选择无交叉反应的封闭剂。洗涤液中加入 Tween-20 可减少交叉反应
杂带较多 目的蛋白有多个修饰位点(磷酸化位点,糖基化位点,乙酰化位点等),本身可以呈现多条带 查阅文献或进行生物信息学分析,获得蛋白序列的修饰位点信息,通过去修饰确定蛋白试剂大小
目的蛋白有其他剪切本 查阅文献或生物信息学分析可能性
样品处理过程中目的蛋白发生降解 裂解液中加入蛋白酶抑制剂,样品处理在冰上进行
上样量过高,太敏感 适当减少上样量
一抗不纯 纯化抗体
一抗特异性不高 重新选择或制备高特异性的抗体
二抗的非特异性结合 增加一个二抗对照,不加一抗,其他操作过程不变,即可验证背景是否是由于二抗所致。可选择其它二抗(特异性更强的,只针对重链)
一抗或二抗浓度偏高 降低抗体浓度
细胞传代较多,导致蛋白变异 使用原代或传代少的细胞作对照
蛋白条带位置
(大小)不对
二聚体或多聚体存在 增加蛋白质变性过程及强度
翻译后剪切 比如很多蛋白是以前体蛋白的形式合成的,在执行功能时需要进行剪切成活化的形式
相对电荷 氨基酸电荷的组成
蛋白修饰 比如糖基化、磷酸化等修饰状态会导致蛋白分子量增加
胶浓度 不同浓度的胶跑出的蛋白条带的位置可能有所偏差
无蛋白条带 抗体孵育不充分 增加抗体浓度,延长孵育时间
酶失活 直接将酶和底物进行混合,如果不显色则说明酶失活了。选择在有效期内、有活性的酶联物
标本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低 设置阳性对照,如果阳性对照有结果,但标本没有则可能是标本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低。可考虑增加标本上样量解决靶蛋白含量低的原因
试剂之间不匹配 一抗与组织种属,一抗与二抗或/和底物与酶系统之间不匹配。通过设置内参照可以验证二级检测系统的有效性
一抗失效 选择在有效期内抗体,幷选择现配现用的工作液
HRP 抑制剂 所用溶液和容器内避免含有叠氮化钠
抗体不能识别测试种属的相关蛋白 购买抗体前应认真阅读抗体说明书,确定其是否能够交叉识别测试种属的对应蛋白
二抗与一抗不匹配 选择针对一抗来源种属的抗体
蛋白条带信号弱 抗体孵育不充分 增加抗体浓度,延长孵育时间
酶活性降低 直接将酶和底物进行混合,如果不显色则说明酶失活了。选择在有效期内、有活性的酶联物
洗膜过度 洗膜时间不宜过长,加入的去垢剂不宜过强或过多,建议使用 0.1% 的弱去垢剂 Tween-20
标本中靶蛋白含量太低 增加样本上样量
抗体活性降低 选择有效期内的抗体,工作液现配现用,避免长时间放置
蛋白转移不充分 可以用丽春红染膜幷结合染胶(考马斯蓝)后确定条带是否转移到膜上或转移过度,适当调整转膜的时间和电流
封闭过度 减少封闭剂的量或缩短时间,换用不同封闭剂类型
曝光时间过短 延长曝光时间
HRP 抑制剂 所用溶液和容器内避免含有叠氮化钠
背景有黑色斑点 抗体与封闭试剂反应 使用前过滤封闭试剂
HRP 偶联二抗中有聚集体 过滤二抗试剂,去除聚集体
暗背景上白色带 HRP 含量过高 降低酶联二抗的浓度
背景有不均匀的白色斑点 转膜过程中有气泡存在 仔细检测,避免存在气泡
抗体分布不均匀 孵育抗体时使用摇床

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