操作篇:Western Blot 蛋白样品制备

做 WB 之前,蛋白质的提取**关重要,成也提取败也提取。现在开讲;

一、单层贴壁细胞总蛋白的提取:

1.倒掉培养液,并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液(或将瓶直立放置一会儿使残余培养液流到瓶底然后再用移液器将其吸走)。

2.每瓶细胞加 3 ml 4℃ 预冷的 PBS(0.01M pH7.2~7.3)。平放轻轻摇动 1 min 洗涤细胞,然后弃去洗液。重复以上操作两次,共洗细胞三次以洗去培养液。将 PBS 弃净后把培养瓶置于冰上。

3.按 1 ml 裂解液加 10 μ PMSF(100 mM),摇匀置于冰上。(PMSF 要摇匀**无结晶时才可与裂解液混合。)

4.每瓶细胞加 400 μ 含 PMSF 的裂解液,于冰上裂解 30 min,为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动。

5.裂解完后,用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧(动作要快),然后用枪将细胞碎片和裂解液移** 1.5 ml 离心管中。(整个操作尽量在冰上进行。)

6.于 4℃ 下 12000rpm 离心 5 min。(提前开离心机预冷)

7.将离心后的上清分装转移倒 0.5 min 的离心管中放于-20℃ 保存。

(个人感觉上述方法可操作性有待加强,细胞中蛋白本来就很少,一瓶 50 ml 的细胞有时按照实验要求只能加 100-200μ 的裂解液,按照上述操作,直接用 200μ 裂解液进行裂解,根本就不够瓶壁上沾的。本人是先用预冷的 PBS(一般数毫升)加入后,用细胞刮刮下细胞,转移**试管中,如果数瓶细胞是收集同一蛋白的,可以放在同一试管,离心后再将蛋白转移到 EP 管中,这样可操作性就比较强)

二、组织中总蛋白的提取:

1.将少量组织块置于 1~2 ml 匀浆器中球状部位,用干净的剪刀将组织块尽量剪碎。

2.加 400 μ 单去污剂裂解液裂(含 PMSF)于匀浆器中进行匀浆。然后置于冰上。

3.几分钟后再碾一会儿再置于冰上,要重复碾几次使组织尽量碾碎。

4.裂解 30 min 后,即可用移液器将裂解液移** 1.5 ml 离心管中,然后在 4℃ 下 12000rpm 离心 5 min,取上清分装于 0.5 ml 离心管中并置于-20℃ 保存。

三、加药物处理的贴壁细胞总蛋白的提取:

由于受药物的影响,一些细胞脱落下来,所以除按(一)操作外还应收集培养液中的细胞。以下是培养液中细胞总蛋白的提取:

1.将培养液倒** 15 ml 离心管中,于 2500rpm 离心 5 min。

2.弃上清,加入 4 ml PBS 并用枪轻轻吹打洗涤,然后 2500rpm 离心 5 min。弃上清后用 PBS 重复洗涤一次。

3.用枪洗干上清后,加 100 μ 裂解液(含 PMSF)冰上裂解 30 min,裂解过程中要经常弹一弹以使细胞充分裂解。

4.将裂解液与培养瓶中裂解液混在一起 4℃.12000rpm 离心 5 min,取上清分装于 0.5 ml 离心管中并置于-20℃ 保存。

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