操作篇:western blot 之 SDS-PAGE 电泳

电泳篇开始

一、清洗玻璃板

一只手扣紧玻璃板,另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。两面都擦洗过后用自来水冲,再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干。

二、灌胶与上样

1. 玻璃板对齐后放入夹中卡紧。然后垂直卡在架子上准备灌胶。

注意:可以用 1% 琼脂糖在垂直电泳槽的左. 右和下部封边,五分钟后重复一次,这样可以保证基本不漏胶。

2. 按前面方法配 10% 分离胶,加入 TEMED 后立即摇匀即可灌胶。灌胶时,可用 10 ml 枪吸取 5 ml 胶沿玻璃放出,待胶面升到绿带中间线高度时即可。然后胶上加一层水,液封后的胶凝的更快。

注意:灌胶时开始可快一些,胶面快到所需高度时要放慢速度。操作时胶一定要沿玻璃板流下,这样胶中才不会有气泡。加水液封时要慢,否则胶会被冲变型。

3. 当水和胶之间有一条折射线时,说明胶已凝了。再等 3 min 使胶充分凝固就可倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。

4. 按前面方法配 4% 的浓缩胶, 加入 TEMED 后立即摇匀即可灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生。插梳子时要使梳子保持水平。由于胶凝固时体积会收缩减小,从而使加样孔的上样体积减小,所以在浓缩胶凝固的过程中要经常在两边补胶。待到浓缩胶凝固后,两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出。

注意:「浓缩胶凝固的过程中要经常在两边补胶」其实说经常有点过了,补 1~2 次就行了,不补胶问题也不大。

5. 用水冲洗一下浓缩胶,将其放入电泳槽中。

注意:冲洗的话个人感觉可以使用 5 ml 的针筒,当然操作不能太粗暴了。

6. 测完蛋白含量后,计算含 20-50μl 蛋白(注意:根据自己的实验需要进行选择,没有固定的量)的溶液体积即为上样量。

取出上样样品** 200μl 的 EP 管中,加入 5×SDS 上样缓冲液**终浓度为 1×。(上样总体积一般不超过 15μl,加样孔的**大限度可加 20μ 样品,其实大一点的垂直电泳槽每孔**大上样量可以达到 40μl,胶做得很好的话 50μ 也是问题不大的)上样前要将样品于沸水中煮 5-10 min 使蛋白变性。

本人心得:可以使用 PCR 仪进行变性,加快速度,这样就不用将水煮沸了,同时在水中煮蛋白样品有下面弊端:1.EP 管容易炸开,样品丢失。2. 容易进水,使样品体积增加,超过电泳**大上样量。

7. 加足够的电泳液后开始准备上样。(电泳液**少要漫过内测的小玻璃板。)用微量进样器贴壁吸取样品,将样品吸出不要吸进气泡。将加样器针头插**加样孔中缓慢加入样品。

注:加样太快可使样品冲出加样孔,若有气泡也可能使样品溢出。加入下一个样品时,进样器需在外槽电泳缓冲液中洗涤数次,以免交叉污染

三、电泳

1. 电泳时间一般 4~5 h,电压为 40 V 较好,也可用 60 V。

注:本人为了加快速度,浓缩胶时用 80-100 V 跑,到分离胶以后用 150-200 跑,结果也不错,总时间 2 h 左右。

2. 电泳**溴酚兰刚跑出即可终止电泳,进行转膜。

注:如果目的条带比较大的话,**好使用可视的蛋白 marker,Fermentas 的 0441 和 0671 比较好,就是有点贵。一般要让目的条带跑过分离胶的 1/3 比较好,不要局限于此说明。

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