操作篇:western blot 之 转膜

转膜篇

1. 转一张膜需准备 6 张 7.0~8.3 cm 的滤纸和 1 张 7.3~8.6 cm 的硝酸纤维素膜。切滤纸和膜时一定要戴手套,因为手上的蛋白会污染膜。将切好的硝酸纤维素膜置于水上浸 2 h 才可使用。

要**:

(1)用镊子捏住膜的一边轻轻置于有超纯水的平皿里,要使膜浮于水上,只有下层才与水接触。这样由于毛细管作用可使整个膜浸湿。若膜沉入水里,膜与水之间形成一层空气膜,这样会阻止膜吸水;

(2)个人感觉其实转膜之前浸湿一下就 ok 了,没有多大问题,可能按照上述操作结果会更好。

2. 在加有转移液的搪瓷盘里放入转膜用的夹子、两块海绵垫、一支玻棒、滤纸和浸过的膜。

3. 将夹子打开使黑的一面保持水平。在上面垫一张海绵垫,用玻棒来回擀几遍以擀走里面的气泡。在垫子上垫三层滤纸,一手固定滤纸一手用玻棒擀去其中的气泡。

要**:

(1)「用玻棒来回擀几遍以擀走里面的气泡」,要**:一手擀另一手要压住垫子使其不能随便移动。

(2)「在上面垫一张海绵垫」要**:可三张纸先叠在一起在垫于垫子上。个人感觉就垫 1 张滤纸也没问题。

4. 要先将玻璃板撬掉才可剥胶,撬的时候动作要轻,要在两个边上轻轻的反复撬。撬一会儿玻璃板便开始松动,直到撬去玻板。

除去小玻璃板后,将浓缩胶轻轻刮去(浓缩胶影响操作),要避免把分离胶刮破。小心剥下分离胶盖于滤纸上,用手调整使其与滤纸对齐,轻轻用玻棒擀去气泡。将膜盖于胶上,要盖满整个胶(膜盖下后不可再移动)并除气泡。

在膜上盖 3 张滤纸并除去气泡。**后盖上另一个海绵垫,擀几下就可合起夹子。整个操作在转移液中进行,要不断的擀去气泡。膜两边的滤纸不能相互接触,接触后会发生短路。

要**:

(1)「要在两个边上轻轻的反复撬」要**:应该边撬边用流水缓缓冲洗

(2)「直到撬去玻板」要**:撬时一定要小心,胶很易裂,要用巧劲

(3)转移液含甲醇,操作时要戴手套,实验室要开门以使空气流通。

(4)**后做成的「三明治」千万不能形成短路,不然有可能会短路烧坏转膜装置(价格不菲,尤其是进口的),**次做的应请老手指教。

5. 将夹子放入转移槽槽中,要使夹的黑面对槽的黑面,夹的白面对槽的红面。电转移时会产热,在槽的一边放一块冰来降温。一般用 60 V 转移 2 h 或 40 V 转移 3 h。

要**:

(1) 实际上应该根据蛋白分子量的大小确定转膜时间,对于小分子量的蛋白,转膜时**好垫两块硝纤膜,以免转膜过头。

因为如果**张膜上蛋白质已经转过了,第二张膜上还有蛋白质可以进行检测;对于大分子量的蛋白,转膜时电压要高一点,一般 80-100 V,时间也要延长一点,开始**好也用两块膜,特别是务必注意加强降温措施。当然转膜是要摸条件的,**好刚开始做的时候摸个转膜的时间梯度。如果由于时间原因来不及做下面实验,可以在 4 度下 12V 转膜过夜

(2) 硝纤膜建议使用 0.22 μm 的小孔径膜,不容易转膜过头;

(3) 不同的转膜装置,转移效率是不一样的,所以换用转膜装置,**好再摸个条件

(4) 转膜时电极方向注意是膜正胶负。

6. 转完后将膜用 1×丽春红染液染 5 min(于脱色摇床上摇)。然后用水冲洗掉没染上的染液就可看到膜上的蛋白。 将膜晾干备用。(一般不需要做这步)