操作篇:western blot 之封闭及杂交

封闭及杂交

在做杂交时,个人建议:还是使用杂交袋进行一抗和二抗的孵育,这样节约抗体。

操作开始:

1. 将膜用 TTBS 从下向上浸湿后,移**含有封闭液的平皿中,室温下脱色摇床上摇动封闭 1 h。必要时可先用丽春红染色(2%乙酸,0.5%丽春红的水溶液)观察蛋白条带,再用去离子水和 TTBS 将丽春红洗脱后封闭,如用蛋白 marker 则可省略此步。

2. 将一抗用 PBST 稀释**适当浓度(在 1.5 ml 离心管中);撕下适当大小的一块儿保鲜膜铺于实验台面上,四角用水浸湿以使保鲜膜保持平整;将抗体溶液加到保鲜膜上;从封闭液中取出膜,用滤纸吸去残留液后,将膜蛋白面朝下放于抗体液面上,掀动膜四角以赶出残留气泡;室温下孵育 1~2 h 后,用 TBST 在室温下脱色摇床上洗两次,每次 10 min;再用 TBS 洗一次,10 min。

3. 同上方法准备二抗稀释液并与膜接触,室温下孵育 1~2 h 后,用 TBST 在室温下脱色摇床上洗两次,每次 10 min;再用 TBS 洗一次,10 min,进行化学发光反应。

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