关于western的一点儿小感触,和大家分享下~

**近的一个月时间里,开始我的实验,因为在本科的时候生物技术试验的时候都是按照试验书上一步步的做,等于没有接触过真正的实验,所以做western几乎是从头学起的。
以下是我自己这一个月的收获,希望对大家有所启示:
1.蛋白样本的制备:因为我提取的是大鼠的海马组织,自己觉得脑组织因为比较软,所以用塑料研磨棒(而且高压后还能重复利用)就OK,不用匀浆振荡器就行。而相比较心肌组织比较硬,可以考虑用那个。如果说有的同学觉得上样的时候样本的溶解度不好,可以在上样前在沸水中再重新煮一下(5分钟),或者是在离心机上小转一下。这样蛋白溶解会好很多。
2.关于制备分离胶和浓缩胶:这点真是深有感触啊,有的同学总抱怨抗体不给力,殊不知制备胶的过程在整个实验占着非常重要的地位,大家可以参考自己的蛋白分子量选择分离胶和浓缩胶的浓度,以及根据胶槽的大小选择分离胶和浓缩胶的毫升数。自己觉得还是在37度温箱里等待胶凝固比较好,比室温效果好。PS:一定不能心急,要各等待30分钟。否则胶没有完全凝固好,对电泳的影响会非常大~
3.关于蛋白上样量,如果自己的蛋白浓度比较高,我的蛋白浓度一般都是30多微克每毫升,所以我试过20,15,10微升的上样量,觉得10微升就足够了。而且因为上样量少,抗体如果比较少,结合相对来说会更好。
4.关于电泳:我的目的蛋白分子量是72KD,所以我一般是总共电泳100分钟差不多,等待**后分离胶里面内参完全跑开再停止电泳。之前拖尾现象也遇到过,自己分析是制胶的时候没有等待胶完全凝固好所致,或者是蛋白的溶解度不好的关系。调整之后,就比较好了。另外电泳液在两块玻璃板之间**好用新的。
5.关于转膜:自己摸索了5次之后,觉得75分钟是**好的转膜时间,胶上的条带会充分的转到PVDF膜上。而且不会转过头。另外赶气泡的时候一定注意看胶和PVDF膜之间是不是接触好了。
6.关于封闭:我自己试过37度脱脂牛奶摇床上摇一个小时和4度脱脂牛奶过夜两种,觉得后者比较好。
7.关于抗体:因为订的是**产抗体,所以一抗都是用完之后不再重复利用,但是二抗保存在—20度还能再用一次。试过一抗4度过夜和37度摇床两小时,可能是我的抗体在37度的温度中发挥效应比较好,目的蛋白都是在37度摇床两小时这种操作方法中出的,和传统的4度过夜不太一样。我也不知道具体原因。
8.关于ECL显色:一般我是曝光3分钟,5分钟和8分钟的效果比较好。

以上就是自己的一点儿小心得,希望大家一起批评指正~