Westernblot基本流程与经验交流

Westernblot基本流程
1.蛋白处理:此步骤是关键,蛋白处理的好否决定结果好坏。取细胞,3000rpm 3min离心,加入含蛋白酶抑制剂(现做现加)的细胞裂解液(本实验室选择RIPA,1×106/L细胞对应100ul),枪尖反复吹吸裂解细胞(此步非常重要,容易出现鼻涕样的液体,此为裂解不充分的缘故,所以应反复吹打或者置于振荡器上,直**鼻涕状液体消失)。冰上放置**少半小时。
2.煮蛋白:12000rpm,15min离心,吸取上清,加入Loading buffer后于沸水中煮5min后,放于-80保存。
3.清水洗玻璃板,无水酒精擦洗干净,夹胶圈,防止漏胶。
4.配制10%分离胶,加入垂直板中,再加入1ml水液封(加入TEMED立即摇匀加入,加水液封时要缓慢些,防止把胶冲变形)。
5.20分钟后,把上清水倒掉,用滤纸把剩余的水吸干。配制5%浓缩胶(按1.5倍体积配液,保证足量),立即加入分离胶上层(**不能出现空泡),立即插梳子。10-20分钟后等胶凝固。
6.准备样品及marker、loading buffer,如果样品是之前保存的,则应再次煮沸5min。
7.将含胶的玻璃板装入电泳槽内,加入电极缓冲液(**好是新配制的),保证玻璃板内的液面高于玻璃板外。拔出梳子,拿注射器将每个加样孔吹一次,把其中可能存在的碎胶吹走,避免影响加样。
8.上样:本人上样有2个习惯。1.上样必须快些,如果上样时间超过半个小时以上,可能会出现孔中样品弥散出来。
2.每个孔均加40ul:样品40ul,Marker加完后再加Loading40ul,非上样孔上loading buffer40ul,保证整块胶重量平衡
9.电泳:本人采用恒流电泳,一块胶10mA(两块则20mA),等染料进入分离胶后,电流加大**20mA,总共约3-3.5h,电泳时周围可放置冰块,起到电泳槽散热的效果。
10.准备好电转液,滤纸、PVDF膜或者NC膜。电泳结束后,取下凝胶,Marker处做标志。上下各四层滤纸(5×8cm),下膜(5.5×8.5cm),上胶,本人用半干转移仪,电流设置为1块胶45mA,转移3.5h。(注意:1.滤纸、膜必须经过电转液浸泡,PVDF膜还得甲醇浸泡 2.上下滤纸之间不能有接触,避免短路 3.膜与胶之间不能有气泡 4. 正反极一定得正确,否则蛋白就转移到滤纸上了)
11.封闭:5%脱脂牛奶室温封闭2h或者4度封闭过夜
12.洗膜:含0.1%Tween-20的PBS洗涤三次,每次5min(提高Tween-20浓度可以去背景)
13.孵育一抗:室温2小时或者4度过夜。**好一次孵育**多两张膜,太多的膜可能一抗结合效果不佳。
14.洗膜:同前
15.孵育二抗:室温一小时(时间过长不宜),不推荐4度过夜
16.洗膜:同前
17.压片:具体步骤不赘述。注意点如下:1.压片时间得由ECL液中显影强度决定,短则2-10秒,长则2-5min
2.一般同时压2--4张片子,**底下那张一般太黑没法用。所以我**底下那张一般不换,压其他的膜也用这张做**底下一张,可以节省胶片
18.压过的膜还可以重新洗膜后孵育新的一抗、二抗。

这就是自己做Westernblot的一般流程,其中犯过很多错误,尤其是一些注意点其实都是自己的出错的地方。写出此贴,也是希望能帮助更多的朋友初步学习Westernblot,其中有不对的地方还希望大家批评指正。

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