Western-blotting:SDS-PAGE和免疫印迹

Western-blotting:SDS-PAGE和免疫印迹
一:蛋白质的提取
1、取出细胞,倒去培养液,用PBS洗涤细胞一次,充分除去PBS液体,把细胞置于冰上。配置细胞裂解液,细胞裂解液用灭菌水配置,然后按照1:100比例加入PMSF混匀,然后按照细胞的多少加入裂解液于培养瓶中,在冰上放置20min。在此期间每隔3-5min摇晃培养瓶,让其充分裂解细胞。
2、裂解结束后,吸取裂解液于另一只1.5ml离心管中,于4℃13000r/min 离心15min。
3、离心结束后,吸取离心管内上清于另一只干净离心管中。于-20℃保存。
4、根据上样量的多少,计算需要处理的样品,在处理样品时按照1:1比例加入2×buffer。于100℃煮5-10min。结束后短暂离心,于4℃备用。
二、主要试剂的配制:
1、30%丙烯酰胺溶液:取29.2g丙烯酰胺,0.8g甲叉双丙烯酰胺,加水**100ml,过滤,棕色瓶内避光4℃保存;
2、1.5M Tris-HCl分离胶缓冲液,pH8.8 (4x):取18.15g Tris,用1M HCl调pH**8.8,加水**100ml,4℃保存;
3、1.0M Tris-HCl在浓缩胶缓冲液,pH 6.8(8x):取12g Tris,用1M HCl调pH**6.8,加水**100ml,4℃保存;
4、电极缓冲液:pH8.3( 1x):取28.8g甘氨酸,6.04g Tris碱,加10ml 10% SDS,加水**1L,室温保存;
5、10% SDS溶液:取10g SDS,加水**100ml,完全溶解后室温保存。
6、10%过硫酸铵溶液(APS):取0.1g过硫酸铵,加水**1ml,每次用前新鲜配制
7、2X样品缓冲液 0.1M TrisCL,PH6.8;0.2M DTT;4%SDS;2%溴酚兰 ;20%甘油
8、电转印液 pH 8.2-8.3: 甘氨酸 14.42g,Tris base 3.02g,dH2O 800ml,甲醇 200ml, 1N HCL调定pH值**8.2-8.3,室温放置 。
9、考马斯亮蓝染色液:考马斯亮蓝R-250 0.25g,甲醇 45ml ,dH2O 45ml,加入冰乙酸10ml, 过滤后使用。
10、脱色液:1号脱色液:甲醇250ml冰乙酸 50ml 加dH2O定溶**500ml; 2号脱色液:甲醇 100ml,冰乙酸 75ml,加dH2O定容**1000ml
11、抗体稀释液:1%BSA/PBS。
12、封闭液:2.5-5%脱脂奶粉
三、电泳
1、配置12% SDS-PAGE凝胶电泳
2、配电泳槽,配5%浓缩胶:水 5.5ml,30%丙烯酰胺 1.3ml,1M Tris(PH6.8)1.0ml,10%SDS 0.08ml,取其中1ml与10%APS0.1ml及TEMED4ul混合,封电泳槽,其余备用。
3、配12%分离胶:水 6.6ml,30%丙烯酰胺 8.0ml,1.5M Tris(PH8.8)5.0ml,10%SDS 0.2ml,10%APS 0.2ml,TEMED0.008ml混合,灌胶。小心覆盖一层液体(75%乙醇)。
4、胶凝后,弃掉覆盖层液体,在浓缩胶中加 10%APS0.08ml,TEMED4ul混合灌胶,在插梳子时小心避免气泡。
5、开始所加电压为80V,**溴酚蓝进入分离胶,将电压升**120V,溴酚蓝到达分离胶底部约0.5cm ( 4—5h左右),电泳完毕,关闭电源。取下凝胶,一块用于考马斯亮蓝染色,另一块用于转印。
6、凝胶考马斯亮兰染色
a. 待溴酚兰指示剂到达分离胶下沿约0.5cm时,关掉电源,倾去缓冲液,取下胶块置于染色盒染色。
b. 染色:在染色盒内倒入染色液,37℃染色3─5h(或室温过夜)。
c. 脱色:用脱色液浸泡,**好能够振摇,换2-3次脱色**背景无色。
d. 凝胶成像保存:用凝胶成像系统将脱色后的凝胶扫描成像保存。
3. 免疫转印:
3.1 小心拆开电泳装置,将胶切角以空位,并将之浸入100ml转移buffer平衡15min。
3.2 推荐预先配好电泳buffer并置于4℃以使之充分去除气体。
3.3 切出比胶稍大的PVDF,在与胶对应处切角作记号。
3.4 以100%甲醇湿润膜15sec,然后转入dH2O中浸润2min。
3.5 转入转印buffer中平衡5min以上。
3.6 组装转印三明治,它由多孔垫片、滤纸(一层)、PVDF、胶、滤纸、多孔垫片组成。
3.7 合上转印盒子,插入转印电泳槽,凝胶面对向负极。
3.8加入足量buffer以45V电压4℃转印18-20hr。
3.9 转印结束后,取出膜并使之干燥,以增强蛋白质结合,室温晾干30min。
4.免疫杂交:(均在室温、振摇条件下进行)
4.1晾干后的膜在2.5%脱脂奶粉-PBS(或者用封闭液)中封闭2 hr。
4.2以PBS洗膜2次×5分钟。
4.3稀释一抗于1%BSA/PBS中与膜孵育1小时。
4.4PBS洗膜15分钟一次,以后再洗4次×5分钟。
4.51%BSA/PBS稀释HRF-标记的二抗并与膜孵育1小时。(其他显色方法)
4.6洗膜:同步骤4。
4.7溶液A与B各0.5毫升等体积混合后,振摇条件下与膜共育1分钟。注意:避光条件下操作。
4.8吸除过量的化学发光试剂,将膜包裹于保鲜膜中。
4.9在暗盒中曝光X片30秒,冲洗胶片,根据结果调整**适曝光时间。

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