RNA凝胶电泳试验

实验基本原理
RNA可以使用非变性或变性凝胶电泳进行检测。在非变性电泳中，可以分离混合物中不同分子量的RNA分子，凡是无法确定分子量。只有在变性情况下，RNA分子完全伸展，其泳动率才与分子量成正比。
判断RNA提取物的完整性是进行电泳的主要目的之一。完整的未降解的RNA制品的电泳图谱应可清晰看到18s rRNA、28s rRNA、5s rRNA的三条带，且28s rRNA的亮度应为18s rRNA的两倍。
实验试剂
1、0.1%DEPC水：200ml双蒸去离子水加0.2mlDEPC焦炭酸、二乙酯混匀，室温放置过夜，高压灭菌。
2、10x电泳缓冲液：吗啉代丙烷磺酸（MOPS）0.4mol/L（pH 7.0）；NaAc 0.1mol/L；乙二胺四乙酸(EDTA) 10mmol/L；
3、50mL变性琼脂糖凝胶（1%）：10x电泳缓冲液5 mL；琼脂糖0.5 g；0.1%DEPC水36.5 mL；加热溶解，稍冷却，加入8.5 ml 37%甲醛。
4、上样缓冲液（染料）：50%甘油，1mmol/LEDTA，0.4% 溴酚兰，0.4%二甲苯蓝。
5、甲酰胺（去离子）。v电泳槽清洗：去污剂洗干净（一般浸泡过夜）——水冲洗——乙醇干燥——3%H₂O₂灌满——室温放置10分钟——0.1%DEPC水冲洗。
操作步骤
1、将制胶用具用70%乙醇冲洗一遍，晾干备用。
2、制胶：称取0.5g琼脂糖粉末，加入放有36.5mL的DEPC水（蒸馏水40ml）的锥形瓶中，加热使琼脂糖完全溶解。稍冷（60~70°）却后加入5ml的10x电泳缓冲液、8.5（9）ml的甲醛（+0.5μl溴化乙锭）。然后在胶槽中灌制凝胶，插好梳子，水平放置待凝固后使用。
3、加样：在一个洁净的小离心管（DEPC处理过的500μl的）中混合以下试剂：电泳缓冲液（10x）2μl、甲醛3.5ml、甲酰胺10ml（μl）、RNA样品3.5（4.5）μl。混匀，置60℃保温10min，冰上速冷。加入3μl的上样缓冲液（染料）混匀，取适量加样于凝胶点样孔内。同时点RNA标准样品。
4、电泳：打开电泳仪(电泳槽内加入1XMOPS缓冲液)，稳压7.5V/cm（ml）电泳。
5、电泳结束后通过紫外透视仪观察。
注意事项
本实验中必须保持RNase污染以免RNA降解。所有试剂用DEPC水配制，用具也用DEPC水冲洗，并灭菌。
①电泳RNA所用器械如制胶的模具、梳子、电泳槽等用肥皂粉洗干净后用双蒸水冲洗二遍后在室温晾干备用。
②用新的1XTBE配制1.2%琼脂糖凝胶，倒胶时溴化乙锭（EB）直接加入凝胶中。
③制备好的琼脂糖凝胶板放入电泳槽后再加入经高压灭菌过的1XTBE，液面只能刚好同胶面平齐，缓冲液不要淹过胶面。
④点样时，样品RNA每10μl加入2μl上样缓冲液，上样缓冲液是用DEPC处理的水配制的50%甘油，另外单独点一样品孔含有3μl溴酚蓝的上样缓冲液作为电泳指示剂，电泳电压4V/cm，电泳时间2h左右便可取出凝胶在紫外灯下观看所提取的RNA的质量或进行拍照记录。