RNA凝胶电泳试验

实验基本原理
RNA可以使用非变性或变性凝胶电泳进行检测。在非变性电泳中,可以分离混合物中不同分子量的RNA分子,凡是无法确定分子量。只有在变性情况下,RNA分子完全伸展,其泳动率才与分子量成正比。
判断RNA提取物的完整性是进行电泳的主要目的之一。完整的未降解的RNA制品的电泳图谱应可清晰看到18s rRNA、28s rRNA、5s rRNA的三条带,且28s rRNA的亮度应为18s rRNA的两倍。
实验试剂
1、0.1%DEPC水:200ml双蒸去离子水加0.2mlDEPC焦炭酸、二乙酯混匀,室温放置过夜,高压灭菌。
2、10x电泳缓冲液:吗啉代丙烷磺酸(MOPS)0.4mol/L(pH 7.0);NaAc 0.1mol/L;乙二胺四乙酸(EDTA) 10mmol/L;
3、50mL变性琼脂糖凝胶(1%):10x电泳缓冲液5 mL;琼脂糖0.5 g;0.1%DEPC水36.5 mL;加热溶解,稍冷却,加入8.5 ml 37%甲醛。
4、上样缓冲液(染料):50%甘油,1mmol/LEDTA,0.4% 溴酚兰,0.4%二甲苯蓝。
5、甲酰胺(去离子)。v电泳槽清洗:去污剂洗干净(一般浸泡过夜)——水冲洗——乙醇干燥——3%H2O2灌满——室温放置10分钟——0.1%DEPC水冲洗。
操作步骤
1、将制胶用具用70%乙醇冲洗一遍,晾干备用。
2、制胶:称取0.5g琼脂糖粉末,加入放有36.5mL的DEPC水(蒸馏水40ml)的锥形瓶中,加热使琼脂糖完全溶解。稍冷(60~70°)却后加入5ml的10x电泳缓冲液、8.5(9)ml的甲醛(+0.5μl溴化乙锭)。然后在胶槽中灌制凝胶,插好梳子,水平放置待凝固后使用。
3、加样:在一个洁净的小离心管(DEPC处理过的500μl的)中混合以下试剂:电泳缓冲液(10x)2μl、甲醛3.5ml、甲酰胺10ml(μl)、RNA样品3.5(4.5)μl。混匀,置60℃保温10min,冰上速冷。加入3μl的上样缓冲液(染料)混匀,取适量加样于凝胶点样孔内。同时点RNA标准样品。
4、电泳:打开电泳仪(电泳槽内加入1XMOPS缓冲液),稳压7.5V/cm(ml)电泳。
5、电泳结束后通过紫外透视仪观察。
注意事项
本实验中必须保持RNase污染以免RNA降解。所有试剂用DEPC水配制,用具也用DEPC水冲洗,并灭菌。
①电泳RNA所用器械如制胶的模具、梳子、电泳槽等用肥皂粉洗干净后用双蒸水冲洗二遍后在室温晾干备用。
②用新的1XTBE配制1.2%琼脂糖凝胶,倒胶时溴化乙锭(EB)直接加入凝胶中。
③制备好的琼脂糖凝胶板放入电泳槽后再加入经高压灭菌过的1XTBE,液面只能刚好同胶面平齐,缓冲液不要淹过胶面。
④点样时,样品RNA每10μl加入2μl上样缓冲液,上样缓冲液是用DEPC处理的水配制的50%甘油,另外单独点一样品孔含有3μl溴酚蓝的上样缓冲液作为电泳指示剂,电泳电压4V/cm,电泳时间2h左右便可取出凝胶在紫外灯下观看所提取的RNA的质量或进行拍照记录。
 

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