影响电泳实验结果的几个因素简述

若将带静电荷Q的离子置于电场中,它的受力简单分析如下: 电荷引力:   F引=EQ 

根据Stokes公式,运动中的颗粒在溶液中受到阻力: F阻=6πrην 平衡时,有F引=F阻,即 EQ=6πrην 整理后得:ν=EQ/(6πrη) 

式中:E——电场强度;r——球形粒子的半径;η——溶液的粘度系数;ν——带电粒子运动速度。 

由上式可知,相同带电颗粒在不同强度的电场里泳动速度是不同的。为了便于比较,常用迁移率代替泳动速度表示粒子的泳动情况。迁移率为带电粒子在单位电场强度下的泳动速度。若以m表示迁移率:上式两边同时除以电场强度E,则得:m=Q/(6πrη) 

由于蛋白质、氨基酸等的电离α受溶液pH值影响,所以常用迁移率m和当时条件下电离度α的乘积即有效迁移率U表示泳动情况: U=m·α 代入m得:U=αQ/(6πrη) 

从上式可以看出,影响分子带电量Q及电离度α的因素如溶液的pH、影响溶液粘度系数的因素如温度、分子的半径r等,都会影响有效迁移率。因此,电泳应尽可能在恒温条件下进行,并选用一定pH的缓冲液。所选用的pH以能扩大各种被分离组分所带电荷量的差异为好,以利于各种成分的分离。 

除以上因素影响电泳结果外,还有离子强度、电渗现象也对电泳构成影响。一般**合适的离子强度在0.02~0.20mol/L之间。离子强度过小会降低溶质的溶解度,离子强度过大会降低被分离组分的泳动速度并增加电泳过程中的发热量,使区带扩散变形。如果电泳不是在溶液中而是在支持介质中进行,还要注意选用无电渗或低电渗物质作支持物。所谓电渗是指在电场中,液体对于固体支持物的相对移动。电渗液流往往破坏电泳中已形成的区带,使其扩散变形。 

综上所述可知,电泳受粒子本身大小、形状、所带电量、溶液粘度、温度、pH值、电渗及离子强度等多种因素的影响。当电泳结果欠佳时,应检查或重新设计实验条件以便改进。  

不同的带电颗粒在同一电场中泳动的速度不同。常用泳动度(或迁移率)来表示。泳动度是指带电颗粒在单位电场强度下泳的速度。 

影响泳动度的主要因素有: 

1、首先决定于带颗粒的性质,即颗粒所带净电荷的数量,大小及形状 

一般说来,颗粒带净电荷多,直径小而接近于球形,则在电场中泳动速度快,反之则慢。泳动度还与分子的形状,介质粘度,颗粒所带电荷有关,泳动度与颗表面电荷成正比,与介质粘度及颗粒半径反比。带电荷的高分子在电解质溶液中把一些带有相反电荷的离子吸引在其周围,形成一离子扩散层。加以电场时,颗粒向符号相反的电极移动即带阳电荷颗粒移向负极,带阴电荷颗粒移向正移;离子扩散层由于带有过剩的与颗粒符号相反的电荷,可以向相反方向移动。结果颗粒与离子扩散之间的静电 引力使颗粒的泳动度减慢,另外,高分了颗粒表面有一层水,在电场影响下,它与颗 粒一起移动,可以认为是颗粒的一部分。 

2、电场强度 

电场强度也称电位梯度,是指单位长度(每一厘米)支持物体上的电位降,它对泳动度起着十分重要的作用。例如纸电泳。测量25厘米长纸条两端电压为250伏特,则电场强度为250伏特/25厘米=10伏特/厘米。 

一般,电场强度越高,带电颗粒移动速度越快。根据电场强度大小,可将电泳分为常压电泳和高压电泳,前者的电压在100-500伏特,电场强度一般是2-10伏特/厘米;后者电压可高达500-1000伏特,电场强度在200-2000伏特/厘米。常压电泳分离 时间需数小时**数天,高压电泳时间短,有时仅几分钟即可,高压电泳主要用于分离氨基酸,肽,核苷酸,由于电压升高,电压也随之增大,故需冷却装置。 

3、电渗作用   

在支持物的电泳中,影响电泳的另一个重要因素是电渗作用。所谓电渗就是指在电场中液体对固体支持物的相对移动,例如在pH8.6时,血清蛋白质进行纸电泳时,γ球蛋白与其他蛋白质一样带负电荷,应该向正极移动,然而它却向负极方向移动,这就是电渗作用的结果。滤纸的纤维间具有大量孔隙带有负电荷,如一束毛细管,进行电泳时蛋白质通过这些孔隙向前移动。纸的孔隙带有负电荷,与带电颗粒一样可以吸引正离子,因此介质沿管壁相对地带的较多的正电荷。在电场中,带负电荷的蛋白质向正极移动,而介质却向反向阴极移动,从而对蛋白质颗粒的泳动起阻碍作用。由于γ球蛋白分子颗粒大,净电荷较少,移动速度慢,电渗作用大于颗粒向前泳动的力,结果γ球蛋白向后退。而其他血清蛋白质,因分子较小,净电荷较多,电渗作用 小于分子向前移动的力,因此分子向前移。所以,血清蛋白质电泳后球蛋白反而在点样位置之后。 

4、溶液的pH值 

溶液的pH值决定了带电颗粒解离的程度,也决定了物质所带净电荷的多少,对于蛋白质,氨基酸等两性电解质而言,溶液pH值离电点越远,颗粒所带净电荷越多;电泳速度越快;反之则越慢。例如血清中几种主要蛋白质的等电点各不相同,白蛋白等电点是4.0。α2球蛋白等电点是5.06,β球蛋白等电点是5.1,γ球蛋白等电点是7.1。当在pH8.6的电泳缓冲液中电泳时,这些蛋白质都带负电荷,它们的泳动速度是白蛋 白< α2球蛋白>β球蛋白>γ球蛋白。因此,当要分离一种蛋白质混合物时,应选择 一种能扩大各种蛋白质所带电荷量差异的pH值,以利于各种蛋白质分子的解离。同 时,为保持电泳过程中溶液pH恒定也须使用缓冲液。