琼脂糖凝胶电泳标准操作流程介绍

一、实验目的 
琼脂糖凝胶电泳是常用的检测核酸的方法,具有操作方便、经济快速等优点。本铜人阵学习DNA琼脂糖凝胶电泳的使用技术, 此关为能力考核,通关成功后,代表具备操作琼脂糖电泳的能力。  
二、实验原理  
     琼脂糖凝胶电泳是常用的用于分离、鉴定DNA、RNA分子混合物的方法,这种电泳方法以琼脂凝胶作为支持物,利用DNA分子在泳动时的电荷效应和分子筛效应,达到分离混合物的目的。DNA分子在高于其等电点的溶液中带负电,在电场中向阳极移动。在一定的电场强度下,DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应,即分子本身的大小和构型是主要的影响因素。DNA分子的迁移速度与其相对分子量成反比。不同构型的DNA分子的迁移速度不同。如环形DNA分子样品,其中有三种构型的分子:共价闭合环状的超螺旋分子(cccDNA)、开环分子(ocDNA)、和线形DNA分子(IDNA)。这三种不同构型分子进行电泳时的迁移速度大小顺序为:cccDNA>IDNA>ocDNA 
影响核酸分子泳动率的因素主要还是:1、DNA分子大小;2、琼脂糖浓度;3、DNA构想;4、所用的电压;5、琼脂糖种类;6、电泳缓冲液 
核酸电泳中常用的染色剂是溴化乙锭(ethidium bromide EB)。溴化乙锭是一种扁平分子,可以嵌入核酸双链的配对碱基之间。在紫外线照射BE-DNA复合物时,出现不同的效应。254nm的紫外线照射时,灵敏度**高,但对DNA损伤严重;360nm紫外线照射时,虽然灵敏度较低,但对DNA损伤小,所以适合对DNA样品的观察和回收等操作。300nm紫外线照射的灵敏度较高,且对DNA损伤不是很大,所以也比较适用。  
三、材料、试剂及器具 1、材料 
不同大小的基因组片段;2、试剂 
Hind III digest DNA Marker(分子量标准)(TaKaRa);D2000(TianGen); BIOWESTAGAROSE(西班牙琼脂糖);加样缓冲液(6x):溴酚黄;电泳缓冲液(1×TAE);溴化乙锭(EB);  3、仪器及器具 
(1)移液器、吸头、锥形瓶 
(2)电泳系统电泳仪、水平电泳槽、托盘、胶托、梳子等。 (3)紫外透射仪、微波炉、电子天平  
四、操作步骤 
1.器具清洗:**先将配胶、电泳、染胶所需要的器具清洗干净,包括托盘、胶托、梳子、电泳槽、染胶盘(EB污染,需独立清洗)。清洗流程为:先用自来水冲洗三次,然后用纯水冲洗三次,**后用纸巾或医用纱布擦干。若需对电泳产物进行胶回收,则还需用75%酒精对器具进行消毒。 
2.配胶:根据基因组片段大小,配置相应浓度的琼脂糖凝胶。**先将锥形瓶洗干净并加入少量纯水煮沸,然后量取一定量的电泳缓冲液(1×TAE)**锥形瓶中,再称取相应量的BIOWESTAGAROSE(西班牙琼脂糖)倒入锥形瓶中,摇匀并用锡纸封口,**后放入微波炉煮,煮胶的过程中需注意安全,应适当摇匀,防止爆沸。煮好的凝胶需无气泡、色泽均匀。 
将煮好的凝胶放入65℃的水浴锅中,待凝胶冷却**65℃时,及时将凝胶倒入装好的干净模具中。 
待凝胶完全凝固后,将凝胶小心转移**4℃冰箱,冷冻30min,然后拔梳子。此时,凝胶需平整、不漏孔,可以用于电泳检测。 
3.电泳准备:先将干净的电泳槽排放整齐并做好标记,然后把凝胶连同胶托一起放入电泳槽正中央,胶孔的方向朝向负极(注意:①放凝胶前,需将胶托底部的凝胶抹干净,防止胶托在电泳槽中滑动;②此时,可顺便观察凝胶是否漏孔),再往电泳槽中倒入一定量的电泳缓冲液(1×TAE)**刚好将凝胶淹没。(注意保持桌面卫生,防止缓冲液洒到桌面) 
4.验孔:用2ul 6×溴酚黄加入到每一个胶孔中,检测凝胶胶孔是否漏孔。若不漏孔,则可在凝胶孔底部看到一条黄色条带;若漏孔,则看不到条带。(注意:验孔完毕之后,需将凝胶固定在电泳槽中央) 
5.上样:将样品、6×溴酚黄按3:1的比例混匀,轻甩后按照规定的顺序上样,上样顺序应与电泳槽上的标记一致,**后点上一定量的Ladder。(注意:①上样时**确保上样顺序正确无误,样品间不混淆,点样后的空管子先放在电泳槽旁边,用于核查;②点样时不戳孔、不外漏、不溢出;③点样时需小心枪头不要碰到凝胶,以免凝胶挪动,若凝胶已经挪动,需等样品完全沉到底部后,再固定凝胶) 
6.电泳:确认已经正确上样后,双手盖上电泳槽盖,接通电泳仪和电泳槽(注意:确认电极正确连接),设置电泳参数:电压:120V,电流:400mA,时间:30min; 注意确认电极、电泳参数完全正确之后,**后按star 键开始电泳。 
7.染胶:电泳结束之后,带上PE手套,小心滑出凝胶,把凝胶转移到干净的PE手套上(注意:PE手套上应做好标记,确保样品、电泳槽、PE手套的标记是一致),小心地将凝胶放入相应标记的EB染胶盘中,盖上盖子染30min。其中,染胶盘放在EB暗房中,EB染液的配方为:100ml 1×TAE + 5ul EB燃料。(注意:①配制EB染液和染胶时需戴上乳胶手套、PE手套,必要时可戴上口罩,染胶时动作要轻,防止溅起EB染液;②注意区分EB污染区与非污染区,防止EB污染区向非污染区扩散) 
8.凝胶成像:带上PE手套,将凝胶从染胶盘中捞出,放在染胶时的那个PE手套上(注意:捞胶时需小心防止凝胶断裂、滑落,尽量把多余的EB染液甩干),将凝胶放入凝胶成像系统中,按照“Tanon凝胶成像系统操作规程”进行操作拍照。(注意:拍照时需严格区分EB污染区与非污染区,防止EB污染区污染电脑、键盘及鼠标),**后保存胶图信息**规定的文件夹内,命名规则为:日期+姓名+工号+部门+电泳铜人阵考核。