五种电泳技术的比较参数

五种电泳技术的比较 SDSPAGE 
  名词解释: 
  相对迁移率(Rf)    
  问答题: 
  1.简述SDS-PAGE的基本原理。   2.影响SDS电泳的关键因素有哪些?  AGE 
 名词解释 1.迁移率 2.电渗 3.电泳 
 问答题 
1.影响电泳迁移率的因素有哪些? 
2.试述琼脂糖凝胶电泳分离脂蛋白的原理。 CAME 
1.CAME的基本原理是什么? 
2.CAME分离血清蛋白电泳时应注意哪些问题? PAGE 名词解释 
1.凝胶总浓度 2.交联度 问答题 
1.与CAME相比,PAGE有哪些特点。 2.试比较CAME与PAGE操作的区别。 3.简述不连续PAGE的原理。 
 
1.琼脂糖凝胶电泳Agarose Gel Electrophoresis 
 Gel Electrophoresis :由琼脂、琼脂糖、淀粉胶及聚丙烯酰胺等物质作支持体的电泳。  特点(characteristic): 
1.可以制成非常均匀的凝胶,带电质点在凝胶的孔中泳动。  2. 电泳操作方法简便,电泳速度快。 
3. 分辨率高,重复性好,电泳图谱清晰。 4. 适用于生化,免疫等定性定量测定。 (一)优点(advantage) 
1.因不含硫酸根和羧基,几乎消除了琼脂的电渗。 
2.对蛋白质吸附极微,故无拖尾现象。 
3.凝胶结构均匀,孔径较大,可用来分离酶的复合物、核酸、病毒 等大分子物质。 4.透明度较好,可直接或干燥成薄膜后进行染色。 
5.不吸收紫外光,可直接利用紫外光吸收法作定量测定。 6.有热可逆性。 
(二)缺点(disadvantage) 
1.机械强度差,易破碎,浓度不能太低。2.易被细菌污染,不易保存,临用前配制。 
3.琼脂糖支持层上的区带易于扩散,电泳后必须立即固定染色。 4.与PAGE相比,分子筛(molecular sieve)作用小,区带少。  应用 
1. 适用于大分子的核酸、核蛋白等的分离、鉴定及纯化 2. 临床生化检验中常用于LDH、CK等同工酶的分离与检测 3. 为不同类型的高脂蛋白血症、冠心病等提供生化指标   影响迁移的因素 
 the size of the molecule 
 conformation of the molecule   the agarose concentration of a gel  Voltage 
百分浓度和分辨率限制 
 Most agarose gels are made with between 0.7% (good separation or resolution of large 
5–10kb DNA fragments) and 2% (good resolution for small 0.2–1kb fragments) agarose dissolved in electrophoresis buffer.  
 Up to 3% can be used for separating very tiny fragments but a vertical polyacrylamide 
gel 聚丙烯酰胺is more appropriate in this case.  
 Low percentage gels are very weak and may break when you try to lift them. High 
percentage gels are often brittle and do not set evenly. 1% gels are common for many applications.  
琼脂糖凝胶分离血浆脂蛋白 
原理:      血清脂蛋白经饱和苏丹黑B预染后,以琼脂糖凝胶为支持介质,在pH8.6巴比妥缓冲液中电泳,根据各脂蛋白的组成、大小、形状分离成不同区带。 
 pH 8.6 > pI ,各种脂蛋白均带负电,电泳时由负极到正极;VLDL为圆形,受阻力小,LDL形态不规则,受阻力大,所以VLDL跑在前。 加样槽在负极,由负极到正极分别是CMLDLVLDLHDL 
2.醋酸纤维薄膜电泳Cellulose acetate membrane electrophoresis,CAME 特点:低吸附作用,低电渗作用,样本用量少,亲水性 1.Low sorption 2.Low electroosmosis  3.Small sample 4.Hydrophilic  电泳图谱不齐 
①点样时血清点加不均匀 ②薄膜局部干燥 
③电泳时供给薄膜的液量不均匀或过少 ④缓冲液变质 
⑤电泳时薄膜位置不正,与电流方向不平行  电泳图谱分理不清 
①点样时血清点加不均匀 
②薄膜局部干燥 
③电泳时供给薄膜的液量不均匀或过少 ④缓冲液变质 ⑤电泳时薄膜位置不正,与电流方向不平行  电泳速度慢 
 电流过低 
 供给薄膜的液量不足  缓冲液离子强度过高 
 薄膜中杂质  
白蛋白区带中间部分不着色,染色不足 染色时间不够、点样过多 γ球蛋白向反方向移动 
电渗现象,可提高缓冲液液面或加大电流量以改进 区带一边长一边短呈扭曲现象 
薄膜未紧压在电泳槽的滤纸桥上,使薄膜接触不良而增大了电阻。  
区带拖尾或区带过于紧密 
缓冲液离子强度<0.05可出现区带拖尾;离子强度>0.075可出现区带过于紧密。 血清蛋白质醋酸纤维薄膜电泳Separate serum protein in cellulose acetate membrane electrophoresis 
[原理] CAME是以醋纤膜(CAM)作支持物的一种区带电泳技术。 
      将血清样品点样于醋纤膜上,在pH8.6的缓冲液中电泳时,血清蛋白质均带负电荷移向正极。由于血清中各蛋白组分等电点不同而致表面净电荷量不等,加之分子大小和形状各异,因而电泳迁移率不同,彼此得以分离。加样:用加样器蘸取血清约5ul,垂直印在CAM粗糙面,点样区距离边缘约1.5cm,电泳时点样面朝下。加上槽盖平衡5分钟后再通电。电压10~15V/cm膜总宽。电泳40~60分钟,泳动距离约达3.5~4cm时即可断电。 由负极到正极可分为五条条带 γ β α2 α1 白蛋白 

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