BIORAD电泳仪及SDS-PAGE凝胶电泳操作规范简述

实验原理 
根据蛋白分子量亚基的不同而分离蛋白,在样品介质和丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂和强还原剂后,蛋白质亚基的电泳迁移速率主要取决于亚基分子量的大小。 实验所用仪器 
FR-200A全自动紫外与可见分析装置   上海复日科技有限公司 电泳仪   BIO-RAD公司 
TS-1型脱色摇床  江苏海门市其林贝尔仪器制造有限公司 实验用试剂 
低分子量蛋白Maker     TAKARA 4*上样缓冲   TAKARA 
Pagn Blue protein staining solution   Fermentas 试剂的配制 1. 贮液的配制 (1) 凝胶储液 
取30g丙烯酰胺+0.8g甲叉双丙烯酰胺0.8g ,先用35ml双蒸水溶解,搅拌,直到溶液变成透明,再用双蒸水稀释**100ml,过滤。棕色瓶4℃保存一个月。 (2)1 mol/l Tris-HCL (PH 8.8) 
12.1g Tris(三羟甲基氨基甲烷)溶解在80ml双蒸水中,用4mol/l盐酸调PH**8.8。再用双蒸水稀释**100ml,保存在4℃冰箱。 (3)1.0 mol/l Tris-HCL (PH 6.8) 
6.06g Tris溶解在40ml双蒸水中,用用4mol/l盐酸调PH**6.8。再用双蒸水稀释**50ml,保存在4℃冰箱。 (4)10%过硫酸铵(APS) 
0.1g过硫酸铵+1ml双蒸水。使用前新鲜配制(5)Tris–甘氨酸电泳缓冲液的配制(25mmol/L Tris;250mmol/L甘氨酸(pH8.3)) 
30.3gTris+ 144.2g甘氨酸+ 10gSDS,双蒸水定容**1L。 每次使用时10倍稀释。 (6) 样品缓冲液 
使用4*SDS-PAGE loading buffer(Takara公司),上样缓冲与样品比例1:3混匀,之后煮沸5min。  2. 凝胶的配制 

具体步骤如下: 
1、样品制备:40 µL蛋白+5*上样缓冲液10 µL,煮沸5 min,冷却后放冰箱下层保存,备用 
2、制胶 
1) 用专用的医用棉口罩将胶板擦拭干净,电泳槽清洗干净,组装模具。 
注:必须使用专用的棉口罩擦拭胶板,且轻轻的向一个方向擦拭,以免划坏胶板。 
胶板和电泳槽未清洗干净,会影响电泳效果。 
2) 按上表成分配制分离胶,迅速摇匀,沿胶的一边,迅速灌入分离胶,注意勿打入气泡,
迅速水封。 3) 放置1.5h。 
4) 倾去蒸馏水,用滤纸将未倒干净的水吸干。 
5) 按上表成分配制浓缩胶,迅速摇匀,沿胶的一边,迅速灌入浓缩胶,注意勿打入气泡,
迅速插入齿梳。 6) 放置1h。 注:新配置的凝胶,室温放置5h,使胶充分凝聚、混匀,之后再使用,效果更好。忌马上电泳。 
3、配制电泳缓冲及上样 
取配好的10*电泳缓冲130ml,用蒸馏水稀释**1300ml。 
将制好的凝胶用电泳夹固定**电泳槽中。注:短板朝里。若只跑一块胶,电泳夹的对面也必须放置一块电泳板。 
倒入电泳缓冲液,液面**短板和长板之间。 每孔上样量**大20ul。蛋白Maker上样量7ul。 
4、 电泳 
80V 45min;120V 45min。 
注:若120v 45min后,溴酚蓝指示剂前沿距离电泳板下端太远,可延长电泳时间,或适当增加电压,待跑**距电泳板下端1cm时停止电泳。 5、 剥胶 
剥胶过程必须浸在蒸馏水中进行。 6、 水洗 
电泳结束后,用蒸馏水洗胶三次,每次10min。 7、 染色 
将胶**于脱色摇床上,使用考马斯亮蓝染色液(fermentas公司)过夜染色。 注:考马斯亮蓝染色液的使用,请严格按照染色液说明上的操作步骤进行。 
考马斯亮蓝染液可重复利用3次,使用一次的染液请倒回使用一次的回收瓶中,使用过两次的染色液倒回使用两次的回收瓶中,用满三次才可废弃。 8、 水洗 
蒸馏水洗1-2小时,洗去背景色。拍照。 9、 清洗胶板和电泳槽。 
注:清洗和擦拭胶板时,请使用专用的医用棉口罩清洗,用水冲洗时,轻轻擦拭,将残留的胶清洗干净,注意不要太用力,以免划坏胶板。洗好后,放置专用的胶架上晾干,晾干后放入相应的胶盒中。 10、 
清理实验台,将实验仪器摆放整齐。

                       
 

WWW.LIUYI17.COM Corporation of China 2010北京六一仪器厂电泳仪电泳槽凝胶成像系统电泳仪电源 公司简介 联系我们

客服电话
  • 15157563004
  • 15157564050