浅谈毛细管电泳技术及在微生物学中的使用

毛细管电泳迅速发展于80年代中后期,是分析科学中继高效液相色谱技术之后的又一重大进展,使分析科学得以从微升水平进入纳升水平,并使单细胞分析乃**单分子分析成为可能[1] 。毛细管电泳(CE)是一类以毛细管为分离通道,以高压直流电场为驱动力的新型液相分离技术。广泛应用于核酸、蛋白质、多肽、药物等大分子物质的分析,但是,不同于毛细管电泳在无机离子 、有机小分子和生物大分子等方面取得的巨大成功,毛细管电泳在微生物方面的应用在**近几年才取得较大进展,并逐渐显现出巨大的应用潜力。在微生物学领域,毛细管电泳除了在微生物基因测序方面得到广泛应用外,在微生物学检测方面应用的报道不多见。本文主要介绍了毛细管电泳的发展、原理、特点、分离模式及在微生物检测中的应用。  
1、 毛细管电泳技术  
1.1毛细管电泳发展历史 
   1937年瑞典化学家Tiselius[2]利用电泳技术**次从人血清中分离出白蛋白和α、β、γ球蛋白,并研制成**台电泳仪,使电泳作为一种分离分析技术有了突破性的进展。经典电泳法**大的局限性在于存在焦耳热,只能在低电场强度下操作,直接影响了其分离效率和分析速度的提高,为了解决这一问题,人们进行了多方探索。1981年,Jorgenson和Lukacs[3]使用内径75um的石英毛细管进行电泳,成功地对丹酰化氨基酸进行了快速,高效分离获得了40万块/m理论塔板的高效率。这一开创性工作成为电泳发展史上一个里程碑,使经典的电泳技术发展为高效毛细管电泳(HPCE)。从此,毛细管电泳在理论研究,分离模式,商品仪器,应用领域等各方面获得了迅猛发展。如今,HPCE可与GC、HPLC相媲美,成为现代分离科学的重要组成部分[4]。  
1.2毛细管电泳基本原理和分离模式 
按毛细管内分离介质和分离原理的不同,毛细管电泳有以下几种分离模式[5]: 
    (1)毛细管区带电泳 毛细管区带电泳(CZE)的分离原理是基于各个分离物质的净电荷与其质量比(比荷)间的差异而进行物质的分离。迄今CZE仍是应用**多的模式,应用范围包括氨基酸、肽、蛋白、离子等的分离。(2)毛细管凝胶电泳 毛细管凝胶电泳(CGE)是将平板电泳的凝胶移到毛细管中作支持物进行电泳,不同体积的溶质分子在其分子筛作用的凝胶中得以分离。常用于蛋白质、寡聚核苷酸、核糖核酸、DNA片段分离和测序及聚合酶链反应(PCR)产物的分析。(3)毛细管胶束电动色谱 毛细管胶束电动色谱(MECC)是采用表面活性剂在运动缓冲液内形成一疏水内核,外部带负电的动态胶束相,利用溶质具有不同的疏水性,在水相和胶束相间分配的差异进行分离。主要用于小分子、中性化合物和药物等的分离。(4)毛细管等电聚焦 毛细管等电聚焦(CIEF)是用两性电解质在毛细管内建立pH梯度,使各种具有不同等电点的蛋白质在电场作用下迁移到等电点的位置,形成窄的聚焦区带。已成功用于测定蛋白质的等电点、分离异构体等。(5)毛细管等速聚焦 毛细管等速聚焦(CITP)利用先导电解质和尾随电解质,使溶质按其电泳淌度不同得以分离。现常用于富集样品。(6)毛细管电色谱 将高效液相色谱(I-IPLC)中众多的固定相微粒填充到毛细管中,以样品与固定相之间的相互作用为分离机制,以电渗流为流动相驱动力的色谱过程称毛细管电色谱(CEC)。以上6种模式为毛细管电泳基本模式,此外,如亲和、免疫毛细管电泳发展趋势也很好。  
1.3 毛细管电泳特点 
   毛细管电泳与高效液相色谱一样同是液相分离技术,但无论从效率、速度、样品用量和成本来说,毛细管电泳显示了一定的优势,与高效液相色谱相比,毛细管电泳柱效更高,可达105
-106  
理论塔板数/m,分离速度更快,几十秒**几十分钟间完成,同时,它几乎不消耗溶剂,而样品用量仅为高效液相色谱几百分之一,仅为几十纳升,毛细管电泳没有高压泵输液,因此仪器成本更低,可以通过改变操作模式和缓冲液的成分,毛细管电泳有很大的选择性,可以根据不同的分子性质对生物大分子,药物等极广泛的分离对象进行有效的分离,而高效液相色谱要消耗许多价格昂贵的色谱柱和流动相[6]。当然,毛细管电泳也存在一些不尽人意的地方,比如毛细管的填充需要专门的灌注技术且制备能力差,毛细管对样本的吸附难于克服从而使其分离效率下降,电泳的高灵敏度依赖于高灵敏度的检测仪等,这些都有赖于进一步完善。  
1.4毛细管电泳---质谱联用 
毛细管电泳---质谱联用综合了二者的优点,成为分析生物大分子的有力工具,是近年来发展迅速的联用技术。毛细管电泳---质谱联用的应用与LC-MS的应用在方法和分析对象上有许多相似之处,如都适用于小分子和大分子的分析,热不稳定,强极性分子及**离子型化合物的分离和分析,当然,毛细管电泳---质谱联用尚存在缺点如浓度灵敏度低,不如LC-MS;不是所有的毛细管电泳分离模式都可方便地用于与质谱相联用;质谱对毛细管电泳分离缓冲液的限制较多。同时,在将毛细管电泳体系与质谱仪联用时,还有以下问题需要注意[4]:(1)无论采用套液技术还是采用十字形接口,毛细管的出口处都会带有高电压。因此良好的电接触对控制接口的工作电流乃**稳定的离子化过程都是很重要的。(2)毛细管插入位置要经细心的优化,位置不当会导致电喷雾工作不稳定。(3)以往发表的毛细管电泳分离工作多数都是在磷酸盐缓冲液中完成的,在毛细管电泳和质谱相连接时要调整为易挥发盐的缓冲液。几种适宜的缓冲液及其浓度:<100mmol/l的甲酸乙酸混合溶液;<50mmol/l的乙酸氨溶液;<10mmol/l十六烷基三甲基氯化铵溶液。(4)为解决毛细管电泳进样量小,不足以在质谱上检出的问题,可以采用等速电泳对样品进行柱上浓缩,以提高进样浓度。 

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