优化Western Blotting的技巧

蛋白质印迹不是一门精确的科学,特别是在方法论意义上,直接获得**的,出版物就绪的结果并不是常态。但是,您可以采取一些步骤来优化Western印迹实验,并确保它们能够以**佳方式开始。这种微调过程称为优化,Western印迹方案的几个阶段可以从中受益。

1. SDS-PAGE

您的蛋白质印迹实验早在您获得膜之前就开始了。你可以追溯到样品制备,但为了空间的利益,让我们从样品分离开始。通过这个,你可以得到你放入的东西 - 如果没有一个好的凝胶,你将无法得到一个好的膜,它将从那里向下螺旋。如果你自己涂上凝胶,要特别注意确保化妆的均匀性。选择正确的丙烯酰胺百分比(参见Proteintech的  Western blot协议 [PDF])。通过抵抗在高电压下运行凝胶的诱惑并使用等效体积的1x样品缓冲液填充空孔,避免染色前“微笑”效应。

**重要的是,加入均匀量的蛋白质; 通过测定确定蛋白质浓度,并准备减少您的装载量,如果您获得“条纹”印迹。Proteintech验证实验室发现,每个泳道30μg蛋白质通常会产生无条纹和良好分离的条带。

2.膜

您的膜选择可以对Western印迹实验的结果产生巨大影响。主要的两种膜类型是PVDF和硝酸纤维素,但现在消费品市场上有几种版本,包括例如针对基于荧光的免疫检测优化的膜或低分子量蛋白质。

PVDF因其韧性,稳定性和对大多数酸和碱的耐受性而受到重视(这意味着它是那些希望剥离和重新探测印迹的人的**膜)。PVDF膜还提供比硝酸纤维素更好的蛋白质保留。

硝酸纤维素膜易于堵塞,通常可提供高信噪比。但是,你将无法剥离和重新探测它们。并注意硝酸纤维素膜的孔径。

**后,关于实验室传统的一句话:不要害怕因实验室规范而改变膜类型。尝试不同的东西可能是**蛋白质印迹的关键。

3.抗体浓度

假设您已经付出了所需的努力来  选择您的抗体(Proteintech也提供了指南),您的下一步应该是确定**佳的工作抗体浓度。

抗体与抗原之间的结合速率(亲和常数)受其在溶液中的相对浓度(以及其他变量,如温度和pH)的影响。抗原丰度通常在Western印迹中固定,因此您通常需要调整抗体浓度以获得更好的印迹。以有组织的方式进行此操作 - 测试几种稀释的抗体,同时保持所有其他参数不变 - 将帮助您确定实验的**佳抗体浓度。

此步骤称为抗体滴定,应在每次使用新抗体或一组实验条件时进行。如果您注意到新批次的多克隆抗体与**后一批抗体的表现不同,也应该这样做。

如何滴定抗体

许多公司在其抗体数据表中提供了推荐的稀释度,这些通常是很好的球场数据,可以帮助您入门; 然而,仍然建议滴定抗体,因为用于获得推荐稀释度的条件可能与您自己的非常不同。如果产品数据表建议使用1:1000的稀释度,请尝试1:250,1:500,1:1000,1:2000和1:4000的系列。

一般情况下,如果您将推荐的稀释液加上推荐稀释液的两倍和一半稀释液(另一侧稀释液稀释液),您将处于正确的轨道上。如果没有推荐的稀释液开始,请尝试1μg/ ml的纯化抗体作为起点。请记住保持所有其他协议参数相同,例如样品类型,孵育时间,洗涤时间和温度。

关于二抗的说明

也许你必须尝试不同浓度的二抗 - 特别是在化学发光检测的情况下。HRP标记的第二抗体的浓度直接影响条带的外观。HRP酶太少会导致化学发光信号低,光谱或光谱缺失。另一方面,过高的浓度会产生“烧坏”的条带。这是由于衬底的快速耗尽导致中间没有信号的带。化学发光试剂孵育的长度也会有所不同(参见下面的#6,检测)。

4.阻塞条件

可以使用各种阻塞缓冲区,这些缓冲区都不适用于所有情况。为每个抗体 - 抗原对尝试几种阻断缓冲液是很重要的。请记住,基于乳汁的阻断缓冲液含有内源性生物素,糖蛋白和可能干扰信号的酶。例如,含乳的缓冲液含有活性磷酸酶,会破坏您对磷酸化蛋白质的检测; 在这些情况下,尝试替代品,如牛血清白蛋白基阻滞剂。

5.洗涤

在大多数情况下,每当我有高背景信号时,修改下一次贯穿的洗涤步骤已被证明是有用的。通常,我通过将吐温-20浓度从0.05%增加到0.1%来实现这一点。您还可以使用以下任何一种策略来改变洗涤强度:增加洗涤时间和体积,执行额外的缓冲液更换或使用更强的洗涤剂(例如,SDS代替吐温20)。

6.检测

检测阶段对于获得良好的Western印迹信号是不可或缺的。有许多化学发光试剂和化学发光替代品,如荧光检测 - 所以如果你目前的检测方法不符合实验室标准,有很多选择。例如,您可以选择具有更高灵敏度的试剂或产生更持久信号的试剂。后一种选择将不可估量地增加印迹的再现性。

在更简单的水平上,化学发光检测可以通过胶片曝光时间进行优化。这可能是**常执行的优化步骤,因为它快速而简单。始终将您的墨水暴露在一系列单独的时间点(但请记住,大约10到15分钟后,所有HRP底物将用完)。你的电影选择也会有所作为。我总是发现专门用于化学发光检测的胶片 - 而不是任何标准的放射敏感胶片 - 是**佳选择。

虽然荧光成像系统可能尚未供每个实验室使用,但您所在机构可能会提供核心或中心设施来提供此技术。基于荧光的检测系统的直接优势是它们能够同时检测多种抗体,无需剥离和重新探测您的印迹。

或者,您可以完全跳过一级抗体的二次检测,并简化您的Western印迹方案,使用HRP结合的一抗识别常见的上样对照和蛋白标签。(以下列出的相关产品均以此格式提供。)

优化的主要目的是增加特定波段的信噪比并减少非特定波段(如果存在)。不可否认,如果您选择优化上述所有变量,则需要花费大量时间; 然而,即使是一两次改动也可能有所不同,从长远来看实际上可以省时间。总的来说,我认为优化是一项非常有价值的工作 - 如果你想获得出版品质的西方印迹,那么这是一项必要的策略。

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