如何提高RNA提取物的质量和数量

分离RNA时,良好的实验室技术**关重要。与固定和神圣的DNA相比,RNA更不稳定。具有核糖糖骨架的RNA含有高反应性羟基(C-OH)基团,确保链不断制造,分解和重复使用。分离的RNA迅速降解,很容易被抗性酶核糖核酸酶(RNases)污染,这些核糖核酸酶随处可见。

在本期Bench Bench中,我们采访了旧金山加州科学院鸟类学和哺乳动物学系主任兼策展人Jack Dumbacher博士,了解他的实验室目前的工作,即分离转录组和小RNA以鉴定宏基因组学病毒序列。与病毒作为病原体的典型观点相反,病毒也可能与宿主具有共生关系或共生关系。了解鸟类中的这些进化关系是Dumbacher的研究目标之一。

“通常情况下,病毒颗粒是低丰度的RNA,”Dumbacher说。“核糖体RNA(rRNA)可能是你**初选择的很大一部分。为了获得良好的恢复,我们尝试通过在田间采集大样本并尽可能小心地保存它们来提高RNA产量。“

优化RNA保存

学院的收集探险通常发生在以生物多样性而闻名的偏远地区,如热带森林或珊瑚礁。Dumbacher团队面临的一大挑战是,由于缺乏冷藏,无法用液氮快速冷冻样品。(RNA在乙醇中稳定降解,这是DNA样品的常见防腐剂。)而是从鸟的泄殖腔(后消化道开口)擦拭样品,放入RNA稳定剂或含有4 M浓度的硫氰酸胍(GITC)缓冲液的其他混合物中。由于盐含量,使用一些RNA稳定剂可能难以在液体样品中进行RNA分离。保持冷藏链不是问题,

确保良好的分离

传统上,GITC缓冲液已被用于裂解RNA提取中的细胞和病毒颗粒,并通过暂时使RNA变性来同时防止RNase酶活性。在这种情况下,必须在裂解前进行一些完整的病毒分离样过滤,以避免核酸汤。Dumbacher团队收集的样品主要是液体形式 - 需要很少的均质化,但良好的分离很重要。在现场,该团队使用0.2μ过滤器 - 类似于旋转柱中的过滤器 - 来过滤较小的病毒颗粒。像完整细胞一样留下较大的颗粒。其他实验室使用冷冻组织样本,必须快速彻底地均质化以获得良好的恢复。无论选择何种方法,都会保留一定量的基因组(gDNA)。

尽量减少RNase暴露

在实验室中,消除内源和外源RNase与纯化RNA之间的接触始终是一个问题。在RNA纯化过程的早期,RNase的外部来源不那么具有威胁性。但是,在RNA制剂不再受GITC溶液等变性剂的保护后,RNA被纯化后,您需要避免激活RNases。蛋白质RNase抑制剂可以隔离剩余的RNase,适用于大多数应用,特别是那些含有内源性RNase的应用。作为预防措施,每当触摸设备时 - 应更换玻璃器皿或移液器 - 手套。(用于RNA纯化的玻璃器皿和器具的推荐培养时间在180°C**200°C时**少为4小时。)学院的比较基因组学实验室尽可能使用DEPC处理过的水代替分子级水。DEPC水通过碱基的组氨酸修饰使RNase失活。当在室内制造水时,建议事先对DEPC水进行高压灭菌,以降解DEPC。

增加RNA产量

如果您尚未指定提取,请开始跟踪。RNA产量因不同组织和样品而有很大差异。对于Dumbacher,收集的每个样品通常RNA含量都很低。获得的RNA量取决于鸟类**后吃的时间,吃的东西,以及其他化学物质或细菌是否在起作用。“即使我们使用RNA含量非常低的样本,当你构建你的库时,它会非常令人印象深刻,你会看到你在另一端获得了多少序列,”Dumbacher说。(他的小组目前正在使用新一代测序技术来分离病毒序列。)

为了增加(先前RNA强健的)组织样品中的RNA产量,避免过度均质化或加热。以30秒的休息间隔以30秒的脉冲均质化可以改善RNA回收。此外,使用二氧化硅旋转过滤器时,用更多的水洗脱会从膜中释放出更多的RNA。无论您的实验室使用何种下游技术,成功的分析都依赖于良好的RNA分离技术。实践是**的。快乐解压!

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