使用DYCZ 24DN型迷你双垂直电泳仪做SDS-PAGE

C.1 实验试剂
(1) 1.5mol/L Tris‐HCl (pH8.8):取18.15g Tris, 加50ml 蒸馏水,缓慢的加浓盐酸**pH8.8(约加3ml);让溶液冷却**室温,pH 将会升高,加蒸馏水**100ml。
(2) 1mol/L Tris‐HCl (pH6.8):取12.1g Tris, 加50ml 蒸馏水,缓慢的加浓盐酸**pH6.8(约加8ml);让溶液冷却**室温,pH 将会升高,加蒸馏水**100ml。
(3) 10% (w/v) SDS: 取10g 的SDS,加蒸馏水**100ml。
(4) 20% (v/v) 甘油: 取20ml 100%甘油,加入50ml 蒸馏水。
(5) 1% (w/v) 溴酚蓝:取100mg 溴酚蓝,加蒸馏水**10ml,搅拌,直到完全溶解,过滤除去聚合的染料。
(6) 1 mol/L 的二硫苏糖醇(DTT):用20 ml 0.01 mol/L 乙酸钠溶液(pH5.2)溶解3.09 g DTT,分装成1ml 小份贮存于‐20℃。
(7) 30%丙烯酰胺溶液(配制含29% (w/v) 丙烯酰胺和1% (w/v) 甲叉双丙烯酰胺的溶液100ml)在通风柜中操作,取29g 丙烯酰胺,1 g 甲叉双丙烯酰胺,加蒸馏水**100ml,缓慢搅拌直**丙烯酰胺粉末完全溶解,用石蜡膜封口,可在4℃存放数月。
(8) 10%过硫酸铵:取0.5g 过硫酸铵,加入5ml 蒸馏水,可保存在密封的管内,于4℃存放数月。
(9) 电泳缓冲液:取 3g Tris,14.4g 甘氨酸,1g SDS,加蒸馏水**1L, pH 约为8.3, 也可配制成10×的储备液,在室温下长期保存。
(10) 1×样品缓冲液:将50μl 1mol/L Tris‐HCl (pH6.8)、200μl 10% SDS、500μl 20%的甘油、200μl二硫苏糖醇(DTT)、100μl 1%溴酚蓝和50μl 的去离子水于1.5ml ppendorf 管中,混合混匀,可在4℃保存数周,或在‐20℃保存数月。
(11) 考马斯亮蓝染液:1.0g 考马斯亮蓝R‐250,加入450ml 甲醇,450ml 蒸馏水及100ml 冰醋酸即成。
(12) 考马斯亮蓝脱色液:将 100ml 甲醇,100ml 冰醋酸,800ml 蒸馏水混匀备用。

C.2 分离胶的灌制
(1) 组装凝胶模具: 按照DYCZ‐24DN 型迷你双垂直电泳仪使用说明书装配好灌胶用的模具。
(2) 本凝胶系统采用 15%丙烯酰胺浓度,线性分离范围为12‐43KD,对于DYCZ‐24DN 型凝胶系统,一次性倒两块板所需要的分离胶的量为约10ml。将30%丙烯酰胺溶液5.0ml、1.5mol/L
Tris‐HCl (pH8.8)2.5ml、10% (w/v) SDS 0.15ml 和去离子水2.3ml 在一个小烧杯中混合,丙烯酰胺是神经毒素,操作时必须戴手套。加入过硫酸铵0.1ml 和TEMED(N,N,N’N’‐四甲基乙二胺)0.004ml后,轻轻搅拌使其混匀(过量气泡的产生会干扰聚合)。凝胶很快会聚合,操作要迅速。小心将凝胶溶液用吸管沿隔片缓慢加入模具内,这样可以避免在凝胶内产生气泡。
(3) 当加入适量的分离胶溶液时(对于小凝胶,凝胶液加**约距前玻璃板顶端1.5cm 或距梳子齿约0.5cm),轻轻在分离胶溶液上覆盖一层1mm~5mm 的异丙醇,这使凝胶表面变得平整。当凝胶聚合后,在分离胶和水层之间将会出现一个清晰的界面。
 
C.3 浓缩胶的灌制
(1) 本凝胶系统采用 5%丙烯酰胺浓度,对于DYCZ‐24DN 型凝胶系统,一次性倒两块板所需要的分离胶的量为约4ml。吸尽覆盖在分离胶上的水后将30%丙烯酰胺溶液0.67ml、1mol/L Tris‐HCl(pH6.8) 0.5ml、10% (w/v) SDS 0.05ml 和去离子水2.7ml 在一个小烧杯中混合。加入过硫酸铵0.04 ml和TEMED 0.004ml,并轻轻搅拌使其混匀。
(2) 将浓缩胶溶液用吸管加**分离胶的上面,直**凝胶溶液到达前玻璃板的顶端。将梳子插入凝胶内,直**梳子齿的底部与前玻璃板的顶端平齐。必须确保梳子齿的末端没有气泡。将梳子稍微倾斜插入可以减少气泡的产生。
(3) 凝胶聚合后,小心拔出梳子,不要将加样孔撕裂。将凝胶放入电泳槽内,在内外电泳槽中加入电泳缓冲液,使凝胶的上下端均能浸泡在缓冲液中。
 
C.4 制备样品和上样
(1) 将蛋白质样品与 1x 样品缓冲液(10μl+10μl)在一个Eppendorf 管中混合。100℃加热3min。10000 r/min 离心5min。
(2) 用微量注射器或 20μl 的移液枪将样品15μl 加入样品孔中。将蛋白质样品加**样品孔的底部。 **后在所有不用的样品孔中加上等体积的加样缓冲液。

C.5 电泳
(1) 将电极插头与适当的电极相接。电流流向阳极。将电压调**200V(保持恒压;对于两块0.75mm 的胶来说,电流开始时为100mA,在电泳结束时应为60mA;对于两块1.5mm 的胶来说,开始时应为110mA,结束时应为80mA)。
(2) 对于两块 0.75mm 的凝胶,染料的前沿迁移**凝胶的底部约需30~40 分钟(1.5mm 的凝胶则需40 min~50min)。关闭电源,从电极上拔掉电极插头,取出凝胶玻璃板,小心移动两玻璃板之间的隔片,将其插入两块玻璃板的一角。轻轻撬开玻璃板,凝胶便会贴在其中的一块板上。
 
C.6 考马斯亮蓝染色
这种染色方法在单条电泳带中蛋白质**小检出量为0.1μg 的蛋白。通常可以根据所需要的敏感度来选择是使用考马斯亮蓝染色或银染色。
(1) 戴上手套避免将手指印留在电泳凝胶上,将凝胶移入一个小的盛有少量考马斯亮蓝(20ml 已经足够)的容器内(小心不要将胶撕破)。或将玻璃板连同凝胶浸在染料中轻轻振荡直**凝胶脱落。
(2) 对于 0.75mm 的凝胶,可在摇床上缓慢震荡5 分钟~l0 分钟,对于1.5mm 的凝胶,则需10 分钟~20 分钟,在染色和脱色过程中要用盖子或封口膜密闭容器口。弃去染液,将凝胶在水中漂洗数次。戴手套以避免将双手染色。
(3) 加入考马斯亮蓝脱色液(约50ml),清晰的条带很快会显现出来,大部分凝胶脱色需要1h,使用过的脱色液则可用水冲洗掉。为了脱色完全,需数次更换脱色液并震荡过夜。

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