Western Blot 中隐藏的生化危机 II:样品制备

Western Blot 又称为蛋白质印迹,是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的基于抗体抗原之间特异免疫反应的一种定量或定性检测蛋白的实验方法。

其基本原理为:聚丙烯酰胺凝胶电泳将不同分子量的蛋白质样品分离,分离后的蛋白被转移到固相支撑物(杂交膜)上,抗体特异性识别目标蛋白,通过酶促反应或者化学发光等方法将目标蛋白可视化,从而对蛋白进行定性或者定量研究。

「良好的开始是成功的一半」,尤其对于生物学实验,如果没有高质量的实验样本,等待我们的很可能是失败的实验结果。优质特异的蛋白样品对 Western Blot 实验**关重要。下面将从蛋白样品制备的方法和试剂选择上给大家一些建议,同时也和大家分享一些因蛋白样品制备不当而导致 Western Blot 实验失败的案例。

蛋白样品制备的基本原则

目的蛋白因其物种来源和组织特异性的不同,在种类和性质上有很大差异,因此并没有一种制备方法可以适用于所有蛋白的提取。这就需要我们进行全面的分析后才能选择**合适的蛋白制备方法,在这个过程中遵循的一个基本原则是「知己知彼」。

首先,「知己」是要了解:样品是来自什么物种?目的蛋白定位在哪种组织或细胞器?是可溶蛋白还是不可溶蛋白?是高丰度蛋白还是低丰度蛋白?在制备时需要保持蛋白的天然活性,还是需要变性蛋白?

其次,「知彼」是要知道:哪种方法或试剂能够防止蛋白降解、聚集、沉淀、变性、修饰?哪种能够去除高丰度蛋白干扰,富集低丰度蛋白?哪种能去除核酸、多糖、脂肪等杂质?哪种能在有限的实验条件下,简便快速地获得高纯度且完整性好的蛋白?

遵循「知己知彼」的原则对蛋白样品制备进行全面分析,就能明确蛋白样品制备的合适方法或试剂。

细胞组织裂解液的选择

裂解液是**普遍使用的蛋白提取试剂,可根据文献或经验自行配制,也可购买商业化的产品。常见的细胞裂解液有 NP40、Triton X-100、RIPA buffer 等。下表是根据目的蛋白的不同定位选择裂解液的建议。虽然裂解液的使用范围比较广泛,能够满足总蛋白的提取,但是无法做到特异蛋白的提取,特别是遇到低丰度蛋白或者活性蛋白功能分析时,通用型的裂解液存在很大的局限性。

样品类型 裂解液(Sigma-Aldrich)
全细胞 NP-40或RIPA(货号:R0278)
细胞质(可溶) Tris-HCl(货号:T3253)
细胞质(细胞骨架) Tris-Triton(货号:X100)
细胞膜结合部分 NP-40(货号:NP40)或RIPA
细胞核 RIPA或核裂解液
线粒体 RIPA或线粒体分离试剂

蛋白抽提试剂盒的选择

蛋白抽提试剂盒的出现弥补了细胞裂解液的应用局限性,特别是针对难提取的样本或者亚细胞器蛋白的提取,例如:针对植物、动物组织/细胞、细菌、酵母等不同样品及细胞核、细胞膜、线粒体、叶绿体、溶酶体等不同亚细胞器的专业提取试剂盒。这类特化试剂盒能够针对目的蛋白的不同来源和不同组织定位进行裂解和提取, 简化实验操作的同时还能提高蛋白提取的得率。

以 Sigma 公司的 CelLytic?系列蛋白提取试剂盒为例:一方面,该系列试剂盒有非变性的裂解配方,可**大程度地保留蛋白活性;另一方面,该系列产品无需经过反复冻融、超声破碎等传统物理裂解方法,并能在很短时间内得到高纯度的蛋白。如:膜蛋白提取试剂盒(CE0050),通过非变性裂解配方,只需 20-30 分钟即可得到具有天然活性的多层跨膜蛋白,且能够有效地去除多糖、核酸等杂质。

此外,Sigma 公司还提供一系列从生物样品中去除高丰度蛋白,富集低丰度蛋白的解决方案。Seppro? 系列产品通过与多种鸡来源 IgY 多克隆抗体的免疫亲和吸附作用,可将样品中的蛋白质进行高度特异性的区分,从而达到富集低丰度蛋白的目的。它可以从人类的血清或血浆样品中去除 14 种高丰度蛋白。此外,Seppro?产品线还能覆盖对小鼠和大鼠样品的处理,以及从植物样品中去除二磷酸核酮糖羧化酶。该类解决方案能显著降低样品的复杂性,利于低丰度蛋白的下游检测。

Western Blot 中的蛋白样品危机

在 Western Blot 中如果蛋白样品制备不当,可能会造成无信号、弱信号、条带大小不正确等实验问题。下表就此类实验问题给出案例分析和解决方案,供参考。

实验问题 原因分析 解决方案
无信号、弱信号 样品中不含待检测蛋白 确定目的蛋白的定位,优化蛋白提取方法
样品蛋白含量低 去除高丰度蛋白,富集低丰度目的蛋白(产品:Seppro/ProteoPrep)
上样量低 增加电泳上样量
蛋白降解 添加合适的蛋白酶抑制剂或磷酸酶抑制剂
条带大小不正确 蛋白具有多种剪接体 查阅文献或通过搜索数据库来确定该蛋白是否存在多种长度不同的编码mRNA
蛋白存在二聚体或者多聚体 增加上样前煮沸变性时间
多带现象 细胞传代次数过多,使其蛋白表达不同 使用原始未传代的细胞株,做对照实验
蛋白具有多种修饰形式 是否存在糖基化、磷酸化、羟基化?
去磷酸化、去糖基化来验证翻译后的修饰
蛋白样本降解 冰上操作,避免污染,确保加入蛋白酶抑制剂
条带扭曲、拖尾、有垂直纹理 蛋白样品溶解度不好 优化蛋白提取方法,寻找合适的裂解液

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