Western Blot 中隐藏的生化危机:抗体选择

Western Blot 又称为蛋白质印迹,是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的基于抗体抗原之间特异免疫反应的一种定量或定性检测蛋白的实验方法。

其基本原理为:聚丙烯酰胺凝胶电泳将不同分子量的蛋白质样品分离,分离后的蛋白被转移到固相支撑物(杂交膜)上,抗体特异性识别目标蛋白,通过酶促反应或者化学发光等方法将目标蛋白可视化,从而对蛋白进行定性或者定量研究。

抗体与抗原之间的特异性识别是 Western Blot 实验中最为关键的一个步骤,选择的抗体是否合适、抗体的质量优劣都关乎实验的成败。下面将从高品质抗体的选择、验证数据对抗体的重要性及内参抗体的选择标准等方面给大家一些建议。

质量是甄选优质抗体的首要标准

2015 年,刊登在 Nature 的一篇文章深度阐述了目前抗体试剂的现状与问题,给全世界科研工作者敲响了警钟。当抗体试剂遭遇信任危机,我们更应深刻反思:如何才能获得高质量、合适的抗体试剂。(查看全文)

市面上常见的抗体有进口品牌、国产品牌、进口品牌国内分装这几种类型。大部分进口品牌在抗体的质量、特异性、效价及保存条件方面较有保障。而有些国产品牌的抗体,在做 Western Blot 时,由于其特异性不高,导致实验结果出现背景不干净,非特异性条带多等问题。进口品牌国内分装则是个别经销商从厂家买到产品后,再通过稀释、分装、重新贴牌之后卖给客户,这样的抗体虽然价格相对便宜,但质量良莠不齐,批间差异较大。

要确保抗体的高质量,我们通常是选择可信赖的品牌,此外,还应注意抗体的供应商渠道是否正规,其供应链物流是否专业。综合这几方面因素,Sigma-Aldrich 都是不错的选择。Sigma-Aldrich 是国内最早实行电子商务的生命科学产品供应商,并以直销为主导,避免了中间流通环节的问题,加上其强大的物流体系,很大程度上降低了销售环节可能带来的实验风险。

完善的验证数据是抗体选择的必要参考

优质抗体还应具备完善的验证数据和详细的信息标注,比如:是否明确标注其可以用于 Western Blot、是否有足够的数据支持证明该抗体适用于某一组织或者样本、是否有明确的抗体建议稀释浓度、该抗体的识别位点是连续的氨基酸序列的一级结构还是非连续性氨基酸的三维结构位点……这些信息和数据的真实性及完整性是保证 Western Blot  实验顺利进行的关键。

关于这一点,HPA 金标抗体及其所提供的数据是一个很好的案例。HPA 抗体数据库覆盖了人类 85% 的蛋白,每支抗体均通过严格的抗原序列筛选及亲和层析纯化流程,确保其特异性和纯度。此外,每支抗体在多种组织样品中经过蛋白芯片、Western Blot、免疫组化、免疫荧光等实验的验证,并获得学术委员会的认证。作为重要的参考数据,所有的实验验证、发表文献和生物信息学预测都公布在 proteinatlas.org 网站供大家免费查询。完善的实验数据支持可避免因信息不完整而造成的选择错误。

有效的内参抗体是实验准确的重要凭证

在 Western Blot 中,内参是由持家基因编码表达的蛋白(Housekeeping Proteins),在各组织和细胞中的表达相对恒定,在检测蛋白的表达水平变化时常用来做参照物。借助内参校正蛋白质定量、上样过程中存在的实验误差,是证明 Western Blot 实验结果真实可靠的重要凭证。一些常见的内参基因及抗体包括 β-actin、GAPDH、PCNA、α-Tubulin 等。

值得注意的是,不同的内参抗体只适用于一定范围的样本和组织,我们需要查阅参考文献,并根据样本和组织的差别选择合适的内参抗体,以确保实验的准确性。(如下表所示)

内参抗体选择标准 参考依据(货号为 Sigma 公司推荐)
根据目的蛋白种属来源 哺乳动物:GAPDH(G8795)、β-actin(A5441)、β-tublin(T2200)
植物:Plant actin(A0480)、Rubisco(R8000)
目的蛋白分子量大小 一般同内参相差5kDa
目的蛋白的定位 核定位蛋白:Lamin B(L9393)、TBP、Histone H3(H9289),PCNA(WH0005111M2)
膜定位蛋白:Na/K ATPase(A276)
线粒体定位蛋白:VDAC1/膜孔蛋白(AV35122) 、COX IV
胞质定位蛋白:GAPDH、β-actin、β-tublin (同样适用于全细胞样品检测)
特异性及具体实验目的 β-actin 在肌肉组织中含量很少
细胞增殖实验中,c-Jun 由于自身表达变化就不适合做内参
凋亡检测时,不适宜选择LaminB、TBP 等作为内参

在 Western Blot 中如果抗体选择或使用不当,可能会造成无信号、弱信号、高背景、有杂带等实验问题,下表就此类实验问题给出案例分析和解决方案,供参考。

实验问题 原因 解决方案
无信号或信号弱 一抗不纯或特异性低 重新选择或制备高特异性的抗体,纯化抗体
抗体不工作 设置对照,分别检查一抗、二抗是否能正常工作;检查一抗及二抗种属来源及亚型,正确选择抗体
抗体浓度低,孵育时间短 增加抗体孵育时间;降低洗涤强度。
背景高 一抗浓度高 优化抗体浓度,推荐使用单抗
二抗浓度高 增加抗体的稀释倍数
非特异性条带 一抗不纯或特异性低 重新选择或制备高特异性的抗体,纯化抗体
二抗非特异性 只设置二抗对照,评估二抗影响
反影或条带为黄色 二抗浓度高 增加抗体的稀释倍数

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