western 显影常见现象、原因及解决方案

Western 荧光检测取决于抗原含量—一抗敏感度—二抗敏感度—底物敏感度—显影和定影效率这一系统。我的经历认为确保万无一失的做法是如果看到荧光则压 10~30s,看不到则同时压两张,10~30 min 洗一张,如果无则再补一张,1 h 后洗。再无,则压过夜。共 3 张片,根据每次结果调整。
 
其中两张片子的压法如下描述: 先剪一张比膜长 2~3 厘米的片子(以供贴胶带),然后剪 2 片细小透明胶带贴到片子的左右两边(贴时胶带留一半用于粘到封口膜上),然后将片子压到膜上,并使透明胶带留出的一半粘到封口膜上。这样就固定了**张胶片,就不会因为放、取第二张胶片而使**张移动了。然后放第二张胶片,与**张片子贴在一起就行,注意片子要干燥,压片前用纸擦干封口膜,以避免被底物液体污染导致与下面一张粘在一起。取时用手轻轻拂过就可以把上面片子与下面一张错开了,不要用手抠,否则下面一张也移动了。 在洗下面一张片子时一定要取掉粘在片子上的胶带,否则在胶带的地方会影响显影。荧光经过下面一张胶片会稍微有些衰减,所以下面一张胶片感光稍微比上面一张强一些。
 
现象-- - - - - - - - - - - - - - - - - - --原因 - - - - - - - - - - - - - - - - --- -- -- --- -- ---解决
反影 (白色条带, 黑色背景) ---- -- -1 HRP 过高 (背景较高) - - - - - - - - ---- - - - **少成倍稀释一抗/二抗 (可 4~10 倍)*注 1
显影后膜上条带处变为黄色---- - -2 HRP 过高 (敏感性太高)- - - - - - - - - ---- -**少成倍稀释一抗/二抗 (可 4~10 倍)*注 2
信号弱或无---- - - - - - - - - - ---- 3 HRP 过高引起底物迅速耗竭- - - - - -- - - -**少成倍稀释一抗/二抗 (可 4~10 倍)*注 3
--- - - - - - - - - - - - - - ---- - - - --4 抗体-抗原系统敏感性过低- --- - - - - - - 提高抗体浓度/蛋白上样量*注 4
- - - - - - - - - - - - - - - ---- - - - --5 转膜不充分/过转- -- -- - - -- - - - - ---- -优化转膜条件*注 5
-- - - - - - - - - - - - - - ---- - - - - -6 HRP 或底物活性降低---- - - -- - - -- - ----测试活性或选用敏感底物 *注 6
高背景---- - - - - - - - - - - - - - - -7 HRP 过高 (背景较高) - -- - - - - - - - - - -- **少成倍稀释一抗/二抗 (可 4~10 倍)*注 7
---- - - - - - - - - - - - - - --- - - ----8 封闭时间不足- - - - - - - - - - - -- - - - -- 延长封闭时间 4 度过夜**好*注 8
--- - - - - - - - - - - - - - --- - -- -- -9 抗体与封闭液有交叉----- - - - - - - - - - -更换封闭液 (如 3%BSA 的 TBST)*注 9
--- - - - - - - - - - - - - - - -- - -- - -10 TBST 洗脱不足 - - - - - - - ---- - --- - - -增加洗脱时间、次数、用量*注 10
---- - - - - - - - - - - - - - -- - -- - --11 暴光时间过长 - - - - - ---- - - ------ -- --降低暴光时间*注 11
- - - - - - - - - - - - - - - - -- - - ----12 抗原-抗体浓度过高 - - - - - - -- --- - - - 降低抗体浓度或蛋白上样量*注 12
条带内无显影的白点----------------13 转膜不良(如有气泡在胶-膜之间) -- -- 精细操作*注 13
--- - - - - - - - - - - - - - - -- - - ----14 膜平衡不均/油脂污染- - - - - - - - - - - 按说明书平衡膜/戴手套用平头镊子持膜*注 14
---- - - - - - - - - - -- ------------ -- 15 膜与 X 光片间有气泡- -- - - - - - - - - - --显影前去除气泡*注 15
非特异性条带- - - - - --------- -- - -16 抗体交叉反应- - - - - - - - - - - -- -- - --**少成倍稀释一抗/二抗 (可 4~10 倍)*注 16
- - - - - - - - - - - - - - - --- ---- - - -17 SDS 非特异性结合蛋白条带 - - --- - ---使用无 SDS 转膜液*注 17
散在小圆斑 - - - - - -- - -- -- - - ---18 封闭液有杂质颗粒- -- - --------- ------- 静置牛奶使大颗粒沉淀,仅用上层*注 18
 
*注 1 其具体问题有二:一是背景较高, 二是没有条带. 形成机制为条带处 HRP 很快将底物耗竭,则不发光不使胶片感光而为白色, 周围因背景 HRP 较低而持续发光一段时间使胶片感光为黑色。这种常见于高浓度抗体并且封闭/洗脱不好的情况下。如果没有背景则就是原因 3 的现象。在暗室可以看到条带周围荧光而条带处为暗。如是则要么通过降低抗体解决,要么动作迅速早期未耗竭底物时压片,否则一旦耗竭通过减少压片时间不能解决问题。也可以过一段时间鼿 RP 稍减后重加底物迅速压片。还有另外一种反影现象就是压出条带粗大模糊,但条带中心是空的白色,原因和上面的一样,主要是条带中心耗竭底物引起的,也可以在暗室看到中空的荧光带,但与上面的区别主要在于特异性要好一些,若继续发展则就是原因 3 的现象。其分析和解决同上。
 
*注 2 其原因主要是 HRP 太高超速催化底物生成的产物使膜发黄, 压出的片子可以是正常的或和原因 1 或原因 3 的现象同时存在,只是一种现象,在压过的膜可以看出来(只在加底物后一段时间出现,几小时后可能还会消退,有时甚**刚加底物 1~2 min 就可以看出来,所以要把握时机)。如果没有达到原因 1 和原因 3 的程度,那么这种情况一定能够看到很强的荧光,是一种良好的状态, 是我们所期盼的。如果压出正常片子而不出现原因 1 和原因 3 的现象, 可以不予处理。但因为荧光太强极易导致条带增粗变大,所以也可以不稀释抗体而通过调整压片时间来解决,一般压 10s~30s,甚**可以 3~5s,即时根据结果在暗室调整, 荧光持续时间长的话都可连续压十数张片子而效果良好。但也有这种情况,就是由于 HRP 过强无论怎么减少压片时间条带都依然粗大(如果时间过短如<3s则可因感光不足导致条带太淡,这样就不可取了,但依然是粗大的、非条带的本来面目),那么如果想获得漂亮条带则**通过降低抗体浓度(减少上样量很不稳定且能力有限,故很少使用)来解决。原因1和3若如是则解决也是一样的。