SDS-PAGE电泳具体步骤概述

一、清洗玻璃板 1、洗洁精轻轻擦洗 2、自来水冲 3、蒸馏水冲 4、筐里晾干 5、梳子用水洗 二、配胶 

材料:玻璃板、梳子、架子、枪(100-1000、20-200、2-20)、DDW、30%Arc-Bis、Tris(pH8.8)、Tris(pH6.8)、10%SDS、10%AP、TEMED。 1、玻璃板对齐后放入夹中卡紧 2、配分离胶 

3、加入玻璃板中 4、加入乙醇1ml 等待0.5小时 

5、用注射器吸出乙醇, 

6、用水冲洗分离胶3次,第4次**后(加入AP、TEMED前)再用注射器吸出 7、配浓缩胶 8、将玻璃板加满 9、放入小梳子 等待0.5小时 

三、上样 

材料:蛋白、marker、针筒、电泳槽、电泳液、枪(2-20ul) 

1、把玻璃板取下,放入小架子,固定于电泳槽(大玻璃板朝外),拔梳子,(若只有一块胶,对面用塑料板) 

2、将小架子加满电泳液,标记位置,用针筒抽电泳液通膜 3、根据要求上样蛋白(如海马),**外侧加马克,用2-20ul枪 四、电泳 

1、放入电泳盒中,盒中加少量电泳液,放上盖子 2、开电泳机 

电压先60V,马克到达分离胶后调制110V,等待约2小时 五、转膜 

材料:6张滤纸、1张PVDF膜(根据分离胶剪,无水甲醇中浸泡1min~2min)、转膜夹、转膜缓冲液 

1、取胶,将浓缩胶轻轻刮去,去掉多余的分离胶, 

2、将裁好的胶、浸过甲醇的PVDF膜和滤纸放入转膜缓冲液中,10min左右, 3、黑色板在下面,纸—胶—膜—纸(注意赶走气泡) 

4、转膜夹放入电泳槽,放满转膜缓冲液,外面放冰块,加满水 等待120分钟,电压100V 

六、免疫反应 

材料:丽春红、TBST、5%牛奶、一抗、二抗 1、取出一小盒,加入少量丽春红,(用完回收)2、把膜取出,扔掉胶,依次放丽春红——TBST,(摇床上) 

3、膜剪成小条带,放入方格盒,放入TBST(摇床),几分钟后放入5%牛奶中封闭抗原(摇床) 等待1小时 

4、配一抗:配5%的牛奶(5g牛奶,加TBST**100ml),将抗体放入牛奶中。 5、包一抗:将膜放入盛有抗体的5%的牛奶中,摇床上1小时 6、4℃冰箱中过夜 

7、第2天,取出膜,TBST中洗,10分钟X3次 8、加入二抗,封膜,摇床上,1.5—2h 七、化学发光 

准备材料:黄色枪头、20-200ul枪、剪刀、镊子、保鲜膜、板、solution、reagent、小盒中的膜 

1、 取出膜,TBST中洗,10分钟X3次 2、膜放入盒中 

3、加solution、reagent**膜上,(A:B=1:1,约60ul) 4、膜放入保鲜膜上包好 

5、膜放入板上进屋 

6、剪胶片放在膜上下,夹在板里, 等待1小时 

7、胶片先放入显影液中 8、胶片先放入定影液中 9、用水冲洗干净

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